Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата

Здравствуйте, меня зовут Рик Паскуа, я студент Лаборатории инженерии стволовых клеток на факультете химических и биологических наук Университета Содружества Вирджинии. В этом видео я продемонстрирую, как наша лаборатория использует недорогой и самодельный спиновой аппарат STO для создания наблюдаемого монослоя плюрипотентных стволовых клеток человека для количественной оценки маркеров клеточной поверхности. Учитывая, что многие иммунохимические протоколы адаптированы для h-ПСК, выращенных в камерных предметных стеклах, в качестве колоний могут возникнуть проблемы с характеристикой экспрессии биомаркеров на индивидуальном клеточном уровне.

Наличие клеток в монослое помогает не только в их визуальном анализе, но и, возможно, в количественной оценке их экспрессии, аппарат для спиновой обработки пазух, который используют наши лаборатории, может быть сконструирован с использованием материалов, найденных в большинстве лабораторий, требует только небольшого образца клетки и не нуждается в каком-либо конкретном реагенте. И что более важно, он способен надежно воспроизводить распространение одиночных клеток для наблюдения. Вот некоторые из вещей, которые вам понадобятся для создания цитозинового аппарата.

Пластиковые предметные стекла, так как они не обязательно должны быть чистыми, вы можете использовать старые камерные горки, если хотите. Предварительно очищенные стекла предметных стекол. Их необходимо очистить, потому что именно здесь будет создаваться монослой клеток.

Фильтровальная бумага, подойдет любая, а также микронаконечники для пипеток. От одного до 10 микролитров — это то, что наша лаборатория использует перед началом строительства. Сначала следует сделать отверстия в пластиковых горках.

Сделать это можно с помощью сверлильного станка. Диаметр отверстий зависит от размера наконечника для микропипетки и должен быть примерно равен ширине самого широкого участка наконечника, используемого для стандартного наконечника для микропипетки от одного до 10 микропипеток. Это должно быть на отметке семи миллиметров.

Количество отверстий, которые вы создаете в пластиковых предметных стеклах, полностью зависит от вашего предполагаемого использования для них. Например, для иммунохимического окрашивания в нашей лаборатории мы обычно используем два отверстия: одно для положительного окрашивания, а другое для контроля отрицательного фона. Эти слайды можно использовать повторно неограниченное количество раз.

Для фильтровальной бумаги просто вырежьте ее кусок по параметрам пластиковой горки. Используйте отверстия предметного стекла в качестве образца для проделывания отверстий на фильтровальной бумаге. Размер отверстия на фильтровальной бумаге должен быть достаточно большим, чтобы наконечник микропипетки мог плотно прилегать, как показано здесь.

Затем нам нужно вырезать соответствующее количество наконечников для микропипеток, по одному на каждое отверстие примерно на половине его длины. Это будет служить основанием предметного стекла, для которого будет создаваться ячеистый монослой. Далее поверх этого будет положена фильтровальная бумага.

Фильтровальная бумага будет служить для впитывания любой лишней среды от окрашивания суспензии. Затем он будет увенчан пластиковой горкой, которая будет служить прочной опорой аппарата. Затем его можно запечатать со всех четырех сторон обычной бытовой лентой.

Наконец, целые наконечники микропипеток затем вставляются в отрезанные наконечники аппарата. Именно туда будут помещены образцы клеток после окрашивания суспензией. Также может быть полезно сначала отметить, где на предметном стекле находятся кончики срезов для более удобного распознавания.

Протокол иммунохимического окрашивания суспензии, используемый в нашей лаборатории, включает в себя первичный сбор стволовых клеток в одноклеточную суспензию, обычно выполняемый путем ферментативного введения с использованием трипсина или неферментативных буферов для диссоциации клеток на основе ЭДТА. Затем клетки переносятся на одну мл, это две мл микроцентрифужные пробирки и их стандартная среда для выращивания. Затем они центрифугируются при давлении 200 G в течение четырех минут.

Одна и та же скорость центрифугирования будет использоваться для всех последующих этапов промывки и отжима. Затем среда отсасывается вручную, будьте особенно осторожны во время аспирации, чтобы убедиться, что клеточная гранула не потревожена. Затем его промывают одним мл PBS дважды, каждый раз отжимая вниз и отсасывая.

Следующий шаг включает в себя фиксацию клеток с помощью 4%-ной пары формальдегида или реагентов PFA, необходимых для этого или перечисленных в сопроводительном описании к этому видео. Клетки инкубируют в 4%-ном парном растворе формальдегида и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Рекомендуется проводить этот этап перед экс-экстраклеточным суспензированием, окрашиванием для использования цитоспинового аппарата.

После этого клетки дважды промывают PBS для удаления следов PFA. Затем ячейку следует заблокировать, чтобы предотвратить неспецифическое окрашивание. После промывки PBS на предыдущем этапе отсадите средство для промывки и добавьте один мл блокирующего раствора.

Затем его следует оставить при комнатной температуре примерно на 45 минут. В ожидании блокирующего раствора можно приготовить первичное антитело, разбавив его до рекомендованного раствора для разведения и блокирования. Храните его при температуре четыре градуса Цельсия.

После того, как клетки находились в блокирующем растворе в течение примерно 45 минут, сверните его вниз и выведите его и суспендируйте их в первичном растворе антитела. В целях выявления неспецифического связывания и фонового контроля лучше всего сохранить по крайней мере один образец в качестве отрицательного. Не было в первичном антителе применено и просто суспендировано в PBS.

Все образцы оставляют при комнатной температуре примерно на один час. При желании фиксированные клетки можно оставить во взвешенном состоянии в первичном растворе антитела на ночь и дважды промыть блокирующим раствором. Вторичный раствор антитела может быть получен во время мытья.

Вторичные антитела обычно чувствительны к свету, поэтому, если это возможно, приглушите свет в лаборатории и накройте все используемые контейнеры алюминиевой фольгой, это делается для предотвращения флуоресцентного обесцвечивания. Реагенты Antifa могут быть включены в протокол, но следует соблюдать осторожность при их использовании, так как это может привести к более высокому фону, например, первичное антитело разбавляется до рекомендуемой концентрации в блокирующем растворе. Нанесите по одному вису на все образцы, независимо от того, был ли в них добавлен первичный или нет после завершения промывки.

Дайте ему постоять в темном месте, например, внутри банки около часа. Промойте клетки одним мл блокирующего раствора дважды. Теперь клетка должна быть готова к ядерному окрашиванию красителем DPI.

Приготовьте раствор DPI в разведении один к 10 000 в PBS вначале, промойте ячейки в одном мл PBS один раз, затем восстановите, суспензируйте в DPI и дайте постоять при комнатной температуре около пяти-10 минут. Как и вторичное антитело, DAPI светочувствительно, поэтому внесите необходимые коррективы для предотвращения флуоресценции, обесцвечивания. Умойтесь один раз одним мл PBS и, наконец, reus.

Снова приостановите через один мл PBS. После этого он должен быть готов к использованию с аппаратом для цитоспинового аппарата. Поместите оптимально не более 100 микролитров раствора для одной клетки в верхнюю часть наконечников микропипеток.

Однако рекомендуется меньшее количество, чтобы предотвратить ненужный перелив или капание. Впоследствии. Поместите аппарат для цитоспина и противовес в настольную центрифугу и вращайте со скоростью 1000 об/мин в течение четырех минут. После этого осторожно разберите аппарат для цитоспина таким образом, чтобы свести к минимуму вероятность смещения клеток со стекла.

Перед установкой убедитесь, что под флуоресцентным микроскопом было установлено положение стоя. Это снимки монослоя BG one V-клетки, окрашенного маркерами поверхности четырех клеток SSCA из аппарата цитоспинового аппарата. Обратите внимание, насколько изолированы клетки друг от друга, что делает возможными наблюдения и записи отдельных клеток.

Что хорошо в этом протоколе, так это то, что он способен воспроизводить монослойные клетки, которые являются осуществимыми, экономически эффективными и легко адаптируемыми для любого рутинного анализа культур стволовых клеток. Итак, я надеюсь, что вы нарисуете это видео и найдете протокол использования в своих собственных исследованиях.