Хронический Сальмонеллы Зараженные Модель мыши

Общая цель данной процедуры — создание модели мышей с хронической сальмонеллезной инфекцией. Для этого сначала готовится раствор salmonella. На втором этапе процедуры мышам вводят путем зондового кормления стрептомицин с последующим введением salmonella или только стрептомицин.

Третьим этапом процедуры является выделение salmonella из фекалий мышей и обнаружение инфекции salmonella в кишечнике мышей с использованием хромогенных чашек BL. Заключительным этапом процедуры является наблюдение и регистрация массы тела мышей, а также фиксация изменений их жизнеспособности после заражения salmonella. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что при введении salmonella через зонд в кишечнике мышей устанавливается инфекция salmonella.

Здравствуйте, я Мишель П. из лаборатории доктора Джонсона с кафедры медицины Рочестерского университета. Также с нами Y из лаборатории Сана. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания модели инфекционного масс-моделирования Alytic Lennar.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения передачи сигналов при взаимодействии хозяина и бактерий, а также туморогенеза. Итак, приступим. Перед началом эксперимента подготовьте достаточное количество чашек с питательной средой LB (бульоном Луриа-Бертони) для каждого штамма salmonella, которые потребуются на протяжении всего исследования.

Пластины можно хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Затем подготовьте культуру salmonella. Достаньте флакон со стоковой культурой salmonella, замороженной при температуре -80 °C, и дайте ей разморозиться на лабораторном столе для последующего высева salmonella.

Прокалите бактериологическую петлю в пламени горелки и погрузите её в размороженный бактериальный сток. Нанесите петлю зигзагообразными движениями на верхнюю треть чашки с LB-агаром. Снова прокалите петлю и поверните чашку.

Двигайте петлей зигзагом, пересекая предыдущие штрихи, чтобы распределить бактерии по второй трети чашки. Повторите процедуру еще раз. Снова прокалите петлю в пламени.

Следите за тем, чтобы петля не проникала в агар. Поместите чашки в инкубатор при температуре 37 °C на ночь для роста колоний. При правильном выполнении процедуры на чашке с salmonella в по крайней мере одной секции должны появиться отдельные колонии.

На следующий день. Выберите клон с чашки с LB-средой с помощью стерильной зубочистки или бактериологической петли и перенесите его в 7 мл LB в пробирке объемом 12 мл. Инкубируйте пробирку при перемешивании при 37 °C в течение примерно пяти часов.

Используйте 0.05 milliliters этой культуры для инокуляции 50 milliliters LB в пробирке Falcon. Инкубируйте при 37 °C без встряхивания в течение примерно 18 часов.

Центрифугируйте 50 мл бактериальной ночной культуры при комнатной температуре со скоростью 5 000 об/мин в течение 10 минут и удалите супернатант. Затем добавьте в пробирку 1,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) для ресуспендирования бактерий, что соответствует соотношению 100 частей LB к трем частям HBSS. После этого доведите общий объем до 15 мл с помощью HBSS, чтобы получить соотношение LB к HBSS 1:10.

Каждой мыши требуется 100 µL разведенной культуры salmonella, или от 1×10⁶ до 1×10⁸ колониеобразующих единиц. Перед началом гаважа лишите мышей воды и пищи за четыре часа до начала эксперимента. Затем непосредственно перед гаважем приготовьте раствор стрептомицина, растворив 7,5 mg порошкового стрептомицина в 100 µL HBSS. Для каждой инъекции подготовьте дополнительный объем раствора, чтобы компенсировать потери перед введением препарата мышам.

Сначала подготовьте иглу для кормления, набрав в неё 100 µL раствора стрептомицина. Достаньте первую мышь из клетки для проведения зондирования и удерживайте её мордой к поверхности лабораторного стола. Крепко захватите кожу в области плеча мыши большим и средним пальцами, вытягивая голову и шею указательным пальцем, чтобы пищевод стал прямым.

Направьте шариковый наконечник иглы для кормления вдоль неба к правой стороне задней части глотки. Затем осторожно проведите её вниз в пищевод и введите 100 µL раствора стрептомицина. Сопротивления при этом ощущаться не должно.

Повторите этот процесс для всех экспериментальных и контрольных мышей, участвующих в эксперименте. Примерно через 20 часов после введения strp de m и зондового кормления, и за четыре часа до введения salmonella, прекратите подачу воды и корма мышам, которым будет проводиться оральное введение salmonella. Выполните зондовое введение каждой мыши аналогичным образом, используя 100 µL раствора salmonella в HBSS.

После проведения зондового кормления перенесите каждую мышь в новую клетку для начала сбора фекалий. Начиная примерно через восемь часов после кормления, извлекайте фекалии из клетки сразу после их появления. Соберите 100 milligrams фекалий мыши в качестве экспериментального образца.

Для анализа фекалий на наличие salmonella проводите сбор образцов ежедневно или еженедельно, в зависимости от продолжительности исследования. Перенесите образец фекалий в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл PBS, тщательно перемешайте на вортексе и центрифугируйте в течение 10 минут при 800 RPM. Перенесите супернатант в чистую пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 6 000 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант и добавьте 200 µL PBS к осадку, затем перемешайте на вортексе до полного ресуспендирования. Далее проведите детекцию salmonella с помощью чашек с агаром BB l roag. На каждую чашку нанесите от 10 до 100 µL раствора фекалий, распределяя его по поверхности, как показано в разделе два.

Виды salmonella приобретают бордовый цвет благодаря метаболическим различиям в присутствии определенных хромогенов. Подсчитайте количество колоний salmonella на чашке, чтобы сравнить степень инфицирования отдельных мышей. В данной экспериментальной процедуре использовались самки мышей линии C 57 black six в возрасте от шести до семи недель, не имеющие специфических патогенов.

Мышей заражали salmonella и стрептомицином в сочетании с HBSS. Контрольную группу мышей подвергали зондовому введению только стрептомицина. Использованные штаммы salmonella включали штамм дикого типа salmonella typhimurium A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, непатогенный мутантный штамм salmonella, а также три штамма FPC из лаборатории доктора Джеймса Мадеры, несущие ген AAV R age, связанный с вирулентностью, в низкокопийной плазмиде PSKW 29. С помощью данного протокола можно обнаружить колонизацию кишечника мыши salmonella tyrian.

Хроническая сальмонеллезная инфекция оценивалась путем анализа фекалий; также собирали образцы тканей кишечника и измеряли массу тела для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания. Как правило, потеря массы тела и летальный исход происходят в течение четырех недель после заражения. Здесь представлены показатели выживаемости через четыре недели после инфицирования.

После того как мыши переживают первые четыре недели после инфицирования, их масса тела начинает расти, а частота летальных исходов снижается в течение последующих 23 недель. В целом, более 65% мышей, инфицированных штаммами сальмонеллы FSY fsy, A VRA null или fsy. A VRA гетерозиготами, могут выживать более шести месяцев с персистирующей сальмонеллезной инфекцией в кишечнике.

После перенесенной острой инфекции у выживших особей все еще сохранялась salmonella, которую можно было обнаружить через шесть месяцев после заражения, используя метод, описанный в данном протоколе. Иммунофлуоресцентный анализ образцов тканей кишечника мыши демонстрирует инвазию salmonella в слизистую оболочку кишечника через 27 недель после заражения. На данном изображении ядра окрашены в синий цвет, а инфицированные salmonella области показаны зеленым цветом.

Как показано на примере контрольной группы, ярко-зеленое окрашивание отсутствует, что указывает на отсутствие колонизации salmonella. В то же время у мышей, инфицированных salmonella, через 27 недель после заражения в слизистой оболочке кишечника наблюдается ярко-зеленое окрашивание. Это свидетельствует о персистенции инфекции salmonella у мышей, прошедших предварительную обработку стрептомицином.

Мы только что продемонстрировали вам способ индуцирования хронической инфекции в мышиной модели. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости свежего приготовления культуры для заражения, соблюдении правильной техники заражения и подтверждении наличия ANA, чтобы убедиться в работоспособности вашей экспериментальной модели. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.