Хронический Сальмонеллы Зараженные Модель мыши

Общая цель данной процедуры заключается в создании модели мышей с хронической сальмонеллезной инфекцией. Для этого сначала готовится раствор salmonella. Вторым этапом процедуры является введение мышам путем зондирования стрептомицина с последующим введением salmonella или только стрептомицина.

Третьим этапом процедуры является выделение salmonella из фекалий мышей и обнаружение инфекции salmonella в кишечнике мышей с использованием хромогенных агаров BL. Заключительным этапом процедуры является наблюдение за массой тела мышей, запись этих данных и фиксация изменений жизнеспособности после заражения salmonella. В конечном итоге можно получить результаты, подтверждающие, что при введении salmonella через зонд в кишечнике мышей развивается инфекция salmonella.

Здравствуйте, я Мишель П. из лаборатории доктора Джонсона с кафедры медицины Университета Рочестера. Я также представляю лабораторию Сана, а я — Y из лаборатории Сана. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания модели массы, инфицированной Alytic Lennar.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения передачи сигналов при взаимодействии хозяина и бактерий, а также туморогенеза. Итак, приступим. Перед началом эксперимента подготовьте достаточное количество чашек с агаром Луриа-Бертони или LB-бульоном для каждого штамма Salmonella, которые будут использоваться на протяжении всего исследования.

Плашки можно хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Затем подготовьте культуру сальмонеллы. Извлеките флакон со стоковой культурой сальмонеллы, замороженной при -80 °C, и дайте ему разморозиться на столе для последующего высева сальмонеллы.

Стерилизуйте инокуляционную петлю в пламени горелки и погрузите ее в размороженный бактериальный сток. Выполните зигзагообразные посевы петлей по верхней трети чашки с LB-агаром. Снова прокалите петлю в пламени и поверните чашку.

Зигзагообразно проведите петлей по предыдущим штрихам, распределяя бактерии по второй трети чашки. Повторите процедуру еще раз. Снова прокалите петлю в пламени.

Следите за тем, чтобы петля не проникала в агар. Для роста колоний поместите чашки в инкубатор при температуре 37 °C на ночь. При правильном выполнении процедуры на чашке с salmonella в по крайней мере одной секции должны появиться отдельные колонии.

На следующий день. Выберите клон с чашки с LB-агаром с помощью стерильной зубочистки или бактериологической петли и перенесите его в 7 мл LB в пробирке объемом 12 мл. Инкубируйте пробирку при перемешивании при температуре 37 °C в течение примерно пяти часов.

Используйте 0,05 мл данной культуры для инокуляции 50 мл среды LB в пробирке Falcon. Инкубируйте при 37 °C без встряхивания в течение примерно 18 часов.

Центрифугируйте 50 мл бактериальной ночной культуры при комнатной температуре при 5 000 об/мин в течение 10 минут и удалите супернатант. Затем добавьте в пробирку 1,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) для ресуспендирования бактерий, что соответствует соотношению 100 частей LB к 3 частям HBSS. После этого доведите общий объем до 15 мл с помощью HBSS, соблюдая соотношение LB к HBSS 1:10.

Каждой мыши требуется 100 µL разведенной культуры salmonella, или от 1×10⁶ до 1×10⁸ колониеобразующих единиц; перед началом зондового введения ограничьте мышей в доступе к воде и корму за четыре часа до начала эксперимента. Затем непосредственно перед введением приготовьте раствор стрептомицина, разведенный из 7,5 mg порошка стрептомицина в 100 µL HBSS. Для каждой инъецируемой мыши обязательно приготовьте дополнительный объем раствора, чтобы компенсировать потери при зондовом введении.

Сначала подготовьте питательную иглу, набрав 100 µL раствора стрептомицина. Достаньте из клетки первую мышь для проведения зондирования и удерживайте ее мордой к поверхности лабораторного стола. Плотно захватите кожу в области плеча мыши большим и средним пальцами, вытягивая голову и шею указательным пальцем, чтобы выпрямить пищевод.

Направьте шариковый наконечник иглы для кормления вдоль неба к правой стороне задней стенки глотки. Затем осторожно введите его в пищевод и введите 100 µL раствора стрептомицина. Сопротивления при этом ощущаться не должно.

Повторите этот процесс для всех подопытных и контрольных мышей. Примерно через 20 часов после введения streptozotocin и зондирования, а также за четыре часа до введения salmonella, уберите воду и корм у мышей, которым будет проведен пероральный ввод salmonella. Выполните зондирование каждой мыши таким же образом, как и ранее, используя 100 µL раствора salmonella в HBSS.

После зондирования перенесите каждую мышь в новую клетку для начала сбора фекалий. Начиная примерно через восемь часов после зондирования, удаляйте фекалии из клетки сразу после их появления. Соберите 100 mg фекалий мыши в качестве экспериментального образца.

Собирайте образцы ежедневно или еженедельно, в зависимости от продолжительности исследования, для анализа каловых масс на наличие salmonella. Перенесите пробу фекалий в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл PBS, подвергните интенсивному перемешиванию на вортексе, затем центрифугируйте в течение 10 минут при 800 RPM. Перенесите супернатант в чистую пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 6 000 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант и добавьте к осадкам 200 µL PBS, затем перемешайте на вортексе до полного ресуспендирования. Далее проведите детекцию salmonella с помощью чашек с агаром BB l roag. На каждую чашку нанесите от 10 до 100 µL раствора фекалий, распределяя их по поверхности, как показано в разделе два.

Колонии вида salmonella приобретают бордовый цвет благодаря метаболическим различиям в присутствии выбранных хромогенов. Подсчитайте количество колоний salmonella на чашке, чтобы сравнить уровень инфекции у отдельных мышей. В данной экспериментальной процедуре использовались самки мышей линии C 57 black six в возрасте от шести до семи недель, не имеющие специфических патогенов.

Мышам вводили сальмонеллу и стрептомицин вместе с HBSS. В качестве контроля мышам вводили только стрептомицин путем зондового кормления. Использованные штаммы сальмонеллы включали штамм дикого типа Salmonella typhimurium ATCC 14028 S FP C, непатогенный мутантный штамм сальмонеллы и три штамма FPC из лаборатории доктора Джеймса Мадеры, несущие связанный с вирулентностью ген AAV R age в низкокопийной плазмиде PSKW 29. С помощью данного протокола можно обнаружить колонизацию кишечника мыши Salmonella typhimurium.

Хроническую сальмонеллезную инфекцию оценивали путем анализа фекалий; образцы массы тела и тканей кишечника собирали для иммунофлуоресцентного окрашивания. Как правило, потеря массы тела и гибель происходят в течение четырех недель после заражения. Здесь представлены показатели выживаемости через четыре недели после заражения.

После того как мыши переживают первые четыре недели после заражения, их масса тела увеличивается, а количество случаев гибели снижается в течение последующих 23 недель. В целом, более 65% мышей, зараженных штаммами сальмонеллы FSY fsy, A VRA null или гетерозиготами fsy. A VRA, способны выживать более шести месяцев с персистирующей сальмонеллезной инфекцией в кишечнике.

После острой фазы инфекции у выживших животных по-прежнему сохранялась сальмонелла, которую можно было обнаружить через шесть месяцев после заражения, используя метод, описанный в данном протоколе. Иммунофлуоресцентный анализ образцов тканей кишечника мышей демонстрирует инвазию сальмонеллы в слизистую оболочку кишечника через 27 недель после заражения. На данном изображении ядра окрашены в синий цвет, а инфицированные сальмонеллой области показаны зеленым.

Как видно в контрольной группе, ярко-зеленое окрашивание отсутствует, что указывает на отсутствие колонизации salmonella. В то же время у мышей, инфицированных salmonella, через 27 недель после заражения в слизистой оболочке кишечника наблюдается ярко-зеленое окрашивание. Это свидетельствует о персистенции инфекции salmonella у мышей, прошедших предварительную обработку стрептомицином.

Мы только что продемонстрировали вам способ индукции хронической инфекции в мышиной модели. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости свежей подготовки культуры для заражения, соблюдении надлежащей техники заражения и определении наличия ANA, чтобы убедиться в работоспособности вашей экспериментальной модели. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.