Цветочные погружением Преобразование Arabidopsis thaliana, Чтобы изучить PTSO2:: β-глюкуронидазы Reporter экспрессии генов

Цветочное погружение используется для трансформации растений arabidopsis с помощью репортерной конструкции. Полученные трансгенные растения затем исследуются на экспрессию репортерного гена. Сначала молодые цветущие растения арабидопсиса опускают в раствор агробактерии к эфесянам, содержащей репортерный конструкт.

Затем растения возвращаются к нормальным условиям роста до тех пор, пока они не произведут семена, небольшой процент которых будет преобразован с помощью чужеродного гена. Третьим этапом процедуры является сбор семян растений и посев их на селекционную среду, содержащую антибиотики. Наконец, осматривается рассада, растущая на селекционной среде с антибиотиками.

Трансгенные саженцы, содержащие чужеродный ген, устойчивы к антибиотикам и остаются живыми, в то время как нетрансгенные сеянцы в конечном итоге белеют и умирают. Экспрессию репортерного гена у трансгенных сеянцев наблюдают путем окрашивания трансгенных сеянцев субстратом репортерного гена и наблюдения за клетками и тканями под рассекающим микроскопом. Здравствуйте, я Хлоя Мара из лаборатории доктора Цзоу на кафедре клеточной биологии и молекулярной генетики Университета Мэриленда.

Я Wna gva, также из лаборатории доктора Z Чили. Сегодня мы покажем вам метод глубины цветка для трансформации растений арабидопсиса. Затем мы покажем вам, как исследовать зарегистрированную экспрессию генов у трансгенных растений.

Наша лаборатория регулярно использует эти процедуры для изучения экспрессии генов и функционирования растений. Итак, приступим. Начните эту процедуру примерно за месяц до преобразования.

Посейте семена кролика в четыре-восемь пятидюймовых квадратных горшков с примерно 10-15 растениями в горшке, а затем поместите семена соды при температуре четыре градуса в холодную комнату на три дня, прежде чем поместить их туда. Камеры для выращивания растений для трансформации мутантных растений арабидопсиса с пониженной фертильностью. Увеличьте количество горшков, добавив еще от шести до 10 горшков.

Выращивайте растения в стандартных условиях. Растениям, выращенным при более коротком дне или более низком температурном режиме, требуется больше времени для цветения и больше времени, чтобы быть готовыми к трансформации. Хороший уход за растениями обеспечивает здоровые растения, которые необходимы для успешного преобразования.

Опрыскивать растущие растения пестицидом рекомендуется, когда растения только завязались и начали цвести. Они готовы к трансформации для повышения эффективности трансформации. За три-четыре дня до трансформации обрежьте основные во флуоресценции побеги, как только они закрутятся.

Чтобы стимулировать образование вторичных побегов за два дня до преобразования, внесите 40 миллилитров LB, содержащих 50 микрограммов на мил. Канин с агробактерией Tema Fasion штамма GV 3 1 0 1, содержащим PTs oh two Gus construct, выращивают в течение ночи в трясущемся инкубаторе при температуре от 20 до 30 градусов по Цельсию. Гас клонирован в вектор PIN 20, который также обладает устойчивостью к мицину.

Два промотора TSO управляют регулируемой экспрессией Gus в клеточном цикле на следующий день, то есть за день до трансформации. Перелейте восемь миллилитров ночной культуры в 400 миллилитров LB, содержащих 50 микрограммов на миллилитр. CIN вырастить за ночь в шатком инкубаторе при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия в тот же день.

Также полейте растения. Это гарантирует, что почва не будет слишком размокать. Инфильтрационная среда во время окунания цветов в день трансформации следовала за поглощением бактерий при 600 нанометрах.

Когда наружный диаметр 600 культуры агробактерий достигнет примерно 0,8, уменьшите культуру агробактерии на ночь в течение восьми минут. При 5 000 об/мин при четырех градусах Цельсия Resuspend, гранулы агробактерии в одном литре свежеприготовленной инфильтрационной среды. Среду не нужно автоклавировать.

Налейте один литр инфильтрационной среды, содержащей агробактерии, в стеклянную посуду размером восемь дюймов на 15 дюймов на два дюйма. Итак, мы собираемся погрузить растения в раствор для инфильтрации. При этом делая это.

Обратите особое внимание, чтобы не окунать почву из горшка в раствор для инфильтрации. Теперь, когда бактерии готовы, переверните горшок и окуните все надземные части растений в раствор для фильтрации инфильтрации. Подержите пять минут.

Окунание по одному горшку за раз, пока все надземные части растения погружены в инфильтрационную среду. Не допускайте впитывания в почву инфильтрационной среды, чтобы снизить вероятность последующего роста грибков на почве. После обмакивания все смоченные горшки положите на бок на несколько слоев бумажного полотенца в поднос.

Бумажные полотенца впитывают избыточное количество инфильтрационной среды. Накройте лоток полиэтиленовой пленкой, чтобы обеспечить высокую влажность. Поместите поддон в камеру для роста растений на следующий день.

Снимите полиэтиленовую пленку с бумажных полотенец и поставьте горшки вертикально. Не поливайте эти растения еще четыре-пять дней после этого. Ухаживайте за растениями в нормальном состоянии, пока они не запустят семена примерно через три недели, и собирайте семена оптом.

Приступайте к выбору трансгенных семян. Сначала выложите тарелки с Ms.Medium, содержащим 50 микрограмм на миллилитр. Можно ли затем измерить мицин и оценить количество семян.

Зная, что 0,1 грамм семян равен примерно 5 000 семян, необходимо отсеять минимум 20 000 семян, чтобы выбрать устойчивые к антибиотикам трансгенные растения. Затем простерилизуйте семена, промыв их с 70% этанолом в 15-миллилитровой пробирке Falcon в течение 30 секунд. Затем промывают семена стерильной водой.

Один раз замочите семена на 30 секунд в растворе, содержащем один к 10 разбавлений магазинного 5%-ного отбеливателя. И, наконец, промойте семена стерильной водой три-шесть раз. После стерилизации семена работают в стерильном колпаке и пипетке закапывают около 5 000 семян в каждую МС пластину.

Содержит 50 миллиграмм на миллилитр. Можно мицином равномерно распределить семена по тарелке и запечатать пластины микропористой лентой 3М во избежание загрязнения. Инкубируйте пластины при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение трех-четырех дней и перенесите пластины в камеру роста растений.

Примерно через 14 дней трансгенная рассада остается зеленой. Они крупнее и развивают настоящие листья в дополнение к cos, по сравнению с нетрансгенными сеянцами, которые становятся бледно-зелеными, останавливают рост и в конечном итоге погибают. Эффективность трансформации должна составлять в среднем от 0,1 до 0,2%.

Около 100 трансгенных линий можно получить, трансформируя четыре горшка с растениями дикого типа. Определите трансгенные растения и медленно выдерните их корни из среды. Перенесите отдельные сеянцы в почвенное покрытие полиэтиленом на один-два дня.

Затем снимите крышку. Дайте растениям вырасти после сбора трансгенных саженцев. Поместите их в стеклянные сцинтилляционные флаконы или пробирки эйнора, содержащие холод.90% ацетона.

Хранение образцов на льду из полистирола, но не из полипропилена. Планшеты для микротитрования также могут использоваться для анализа большого количества образцов. После того, как все образцы будут собраны, поместите флаконы при комнатной температуре на 20 минут.

За это время сделайте свежий буфер для окрашивания без xgl и выложите на лед. Кроме того, приготовьте буфер для окрашивания, содержащий xgl, путем разбавления 100 миллимолярного стокового раствора xgl до конечной концентрации двух миллимоляров xcl. В конце 20-минутной инкубации удалите ацетон из образцов и добавьте буфер для окрашивания без xgl.

Затем удалите буфер для окрашивания без xgl из образцов и добавьте буфер для окрашивания, содержащий xgl, к образцам. Продолжайте инфильтрацию образцов под вакуумом в течение 15–20 минут. Медленно выпустите вакуум и убедитесь, что все образцы опустились под поверхность окрашивающего раствора.

При необходимости повторяйте инфильтрацию до тех пор, пока все образцы не опустятся под поверхность. После сброса вакуума, после вакуумной инфильтрации, инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи в буфере для окрашивания, содержащем xgl. На следующий день достаньте образцы из инкубатора и удалите буфер для окрашивания.

Промойте образцы в последовательной серии этанола при комнатной температуре в течение 30 минут для каждой замены. Наконец, зафиксируйте ткани в фиксаторе FAA на 30 минут при комнатной температуре. Затем снимите фиксатор FAA и добавьте 70% этанола.

Исследуйте ткани под препарирующим микроскопом, оснащенным цифровой камерой, или храните при температуре четыре градуса по Цельсию для последующего просмотра на изображенном здесь растении. Темно-синий цвет отражает активность ГУС, вызванную промотором TS O2. Верхушка желоба имеет молодой лист первичный с активно делящимися клетками.

Это отражается в высокоэкспрессированном гене TS O2 для биосинтеза DNDP, на что указывает темно-синий цвет активности Gus. Также можно наблюдать боковой примордиальный корнь, окрашенный в синий цвет, а также окрашивание на кончике корня. Неоднородная спорадическая картина характерна для фазоспецифичной экспрессии клеточного цикла.

Мы только что показали вам, как использовать метод цветочного погружения для трансформации растений arabidopsis и изучить экспрессию репортерного гуса у трансгенных сеянцев. При проведении этой процедуры важно иметь здоровые растения. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.