Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной для белок-белковые взаимодействия в Лук ячеек с использованием генной пушки Helios

Эта процедура проверяет in vivo белковое взаимодействие между двумя регуляторами транскрипции Arabidopsis, сокращенно SEU и lu holog или LUH. С помощью биомолекулярной флуоресцентной комплементации сеус сливают с конечным концевым фрагментом желтого флуоресцентного белка, или YFP и LUH сплавляют с С-концевым фрагментом Y-F-P-D-N-A двух плазмидных конструкций. Seuss, NYFP и L-U-H-C-Y-F-P бомбардируются эпидермальными клетками лука для проверки их взаимодействия.

Взаимодействие между Сьюзом и LUH приводит к ассоциации концевых и С-концевых фрагментов YFP в ядрах, что приводит к флуоресценции YFP в ядрах. После инкубации в течение 16 – 20 часов в темное время суток эпидермальную кожуру лука наблюдают под флуоресцентным микроскопом с целью визуализации флуоресценции. Здравствуйте, я Кортни Холландер из лаборатории доктора Чжи Лу на факультете клеточной биологии и молекулярной генетики Университета Мэриленда.

Сегодня мы покажем вам процедуру тестирования белок-белкового взаимодействия в клетках лука с помощью генной пушки BioRad Helios. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для тестирования белок-белковых взаимодействий и локализации белка в растительных клетках. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, подготовьте картриджи для генной пушки Helios в соответствии с видеопротоколом Джо Вудса и Зето 2008 года, который подробно демонстрирует процедуру подготовки картриджа для каждого препарата картриджей. 50 микрограммов общей плазменной ДНК смешиваются с 12,5 миллиграммами частиц золота и 0,5 миллиграммами на миллилитр раствора PVP для BIFC. Комбинируя один и тот же картриджный препарат, две плазменные ДНК предполагаемых взаимодействующих белков Seuss слились с N концевой половиной YFP, сокращенно seus, NYFP и LU Homolog слились с C концевой половиной YFP сокращенно L-U-H-C-Y-F-P.

Общее количество составляет 50 микрограммов на преп, что дает до 50 картриджей с одним микрограммом ДНК на 0,25 миллиграмма золота на картридж. Каждый патрон на один выстрел. После подготовки картриджа проверьте картриджи, чтобы узнать, эффективно ли продвигаются частицы золота.

Оберните квадратный кусок параформы вокруг чашки Петри. Затем установите давление гелия в диапазоне от 150 до 200 фунтов на квадратный дюйм и выстрелите только что изготовленными патронами в квадрат параметра. Наблюдайте за слабыми частичками золота на парфюме.

Различное количество частиц золота может попадать на парфюм при разном давлении гелия. Однако, если существенной разницы нет, выбирайте более низкое давление для бомбардировки. Этот тест также указывает на область, охваченную каждым выстрелом.

Чтобы подготовить луковые ткани, снимите кожуру с крупной желтой луковицы с помощью чистого и острого лезвия бритвы. Вырежьте прямоугольный участок два на восемь сантиметров, глубиной четыре-пять слоев. Достаньте прямоугольную луковую ткань и выбросьте два внешних слоя.

Оставшиеся слои лука нарезать примерно на 1,5 сантиметра квадратными кусочками. Поместите кусочки лука в чашку Петри, содержащую кружочки из трехмиллиметровой фильтровальной бумаги. Смоченную стерильной водой крышку накрываем чашкой Петри.

Кусочки лука готовы к бомбардировке. Первый: Загрузите картриджи в белые круглые держатели картриджей, загрузите картриджи, содержащие различные плазмидные конструкции, в разные патронные держатели. Каждый патронный держатель может вместить до 12 патронов на 12 выстрелов.

Здесь загружаются три разных держателя. Первый держатель содержит картриджи, содержащие 35 S-G-F-P-A сильного и конститутивного промотора из вируса мозаики цветной капусты. Эта плазмида служит положительным контролем.

Второй держатель снаряжен экспериментальными патронами, содержащими равное количество S-E-U-N-Y-F-P и L-U-H-C-Y-F-P. Третий патронный держатель снаряжен картриджами, содержащими равную молярную смесь вектора шипа шайбы и специи LUH шайбы. Это также служит негативным контролем.

Вставьте аккумулятор и свежий вкладыш ствола в генную пушку Helios. Убедитесь, что и гильза ствола, и пистолет имеют соответствующие уплотнительные кольца. Далее вставьте пустой патронный держатель в генный пистолет с отметкой No 12 на патроннике, обращенном к верхней части пистолета.

Переместите держатель картриджа один или два раза, чтобы убедиться, что он вставлен правильно. Затем прикрепите пистолет к гелиевому баллону и отрегулируйте давление в диапазоне от 150 до 200 PS. Я ношу защиту для ушей и стреляю из пистолета несколько раз, удерживая боковую кнопку при нажатии на спусковой крючок. При стрельбе из пистолета с пустым патронным держателем, заряженный он очищает патронник пистолета и обеспечивает стабильное давление.

Перед съемкой ДНК, выстрел кусочка луковицы здесь может быть отрицательным контролем фоновой флуоресценции. Чтобы выстрелить золотыми частицами, покрытыми ДНК, снимите пустой держатель картриджа и вставьте первый заряженный держатель картриджа, содержащий положительный контроль. Переместите патронный держатель так, чтобы патрон, предназначенный для стрельбы, располагался на дне патронного держателя.

Теперь положите кусочки лука в середину пустой чашки Петри самым внутренним слоем лука вверх. Упритесь вкладышем ствола генного пистолета в чашку Петри и выстрелите из пистолета. Переходите к следующему патрону и стреляйте другим кусочком лука.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не выстрелят четыре-пять штук лука. Каждый кусочек лука отстреливается только один раз после выстрела. Переложите подвергшийся бомбардировке кусочек лука в чашку Петри, содержащую влажную трехмиллиметровую фильтровальную бумагу, чтобы выстрелить экспериментальными патронами.

Пересаживаемся на картридж Holden. Во-вторых, не забудьте поменять вкладыш ствола, чтобы предотвратить загрязнение. Выстрелите в четыре-пять кусочков лука, как показано только что для положительного контроля.

Затем пересаживаемся на картридж Holden. Номер три, содержащий отрицательную контрольную ДНК. И снова стреляем по четыре-пять штук лука.

Замените вкладыш ствола, чтобы предотвратить загрязнение. После бомбардировки. Накройте крышками чашки Петри, содержащие кусочки лука.

Оберните их параформом, чтобы предотвратить высыхание. Инкубируйте кусочки лука при комнатной температуре в темноте от 16 до 48 часов. Как только бомбардировка будет завершена, выключите газ и сбросьте давление, прежде чем отсоединить генную пушку от гелиевого бака, отвинтите гильзу ствола и снимите держатель картриджа и использованные картриджи.

Наконец, очистите держатели патронов и вкладыши ствола, погрузив их в стакан с мыльной водой и ультразвуком. На 20 минут. После этого промойте водой, чтобы удалить все остатки мыла.

Замочите в 70% этаноле на час, а затем высушите на бумажных полотенцах. Приступайте к наблюдению за кусочками лука через 16-20 часов после бомбардировки. После инкубации подвергшихся бомбардировке кусочков лука в течение 16-20 часов при комнатной температуре используйте щипцы с плоскими концами, чтобы медленно снять слой одной клетки с внутреннего эпидермиса лука.

Это тот слой, который прямо обращен к орудию во время бомбардировки. Положите очищенный слой на каплю воды на слайд-крышку с крышкой-крышкой. Но будьте осторожны, чтобы свести к минимуму пузырьки.

Наблюдайте за флуоресценцией GFP или YFP с помощью флуоресцентного микроскопа, такого как наблюдатель zes axio, точка Z 1 показана здесь под светлым полем микроскопа. Сначала проверьте цитоплазматический поток, чтобы убедиться, что клетки живы. Для этого.

Выставьте предметное стекло на яркое поле света на несколько минут, чтобы разогреть ткань лука, а затем ищите движущиеся пластики цитоплазматической струи не всегда легко увидеть, поэтому не расстраивайтесь, если она не видна четко. Для обнаружения флуоресценции используйте соответствующие фильтры возбуждения и детектирования для GFP или YFP. Также проверьте отрицательные элементы управления, которые представляют собой кусочки лука, выстреливаемые с помощью нефлуоресцентной плазмиды.

Слабые желтые сигналы могут появляться от раненых клеток, обломков и лука. Кроме того, проверьте положительный контроль. Плазмида, содержащая конститутивно экспрессируемый флуоресцентный репортер.

Флуоресценция GFP наблюдается в некоторых, но не во всех клетках. Пузырьки воздуха также могут давать фоновую флуоресценцию. Видимые сигналы GFP от эпидермальных клеток лука указывают на то, что патроны, ткани лука и стрельба из генного пистолета подготовлены и выполнены должным образом.

Здесь показана сильная флуоресценция, наблюдаемая от 35 SGFP-положительной плазмиды. Сильная флуоресценция наблюдается во всей клетке, включая ядро и цитоплазму. Светлопольное изображение позволяет увидеть соответствующие контуры клеток и ядер.

Не каждая клетка преображается. Флуоресцентный сигнал YFP обнаруживается в ядре луковой клетки, когда экспериментальная комбинация Seuss, NYFP и L-U-H-C-Y-F-P бомбардируется в клетки лука, что указывает на то, что Seuss NYFP и L-U-H-C-Y-F-P взаимодействуют in vivo. Тем не менее, эта опосредованная взаимодействием флуоресценция значительно слабее, чем опосредованная 35 SGFP флуоресценция в положительном контроле.

Кроме того, в ядрах локализуются факторы транскрипции SEUS и LUH. Таким образом, флуоресценция YFP наблюдается только в ядре. Кроме того, количество флуоресцентных клеток значительно ниже, чем у положительного контроля 35 SGFP.

Это связано с тем, что B FFC работает только тогда, когда обе плазмиды-партнера экспрессируются в одних и тех же луковых клетках. Флуоресцентный сигнал не обнаруживается в луке, бомбардируемом патронодержателем номер три, содержащим смесь шипового шипа, вектора и L-U-H-C-Y-F-P Как ожидается от отрицательного контроля. Мы только что показали вам, как бомбардировать луковые клетки для тестирования на взаимодействие белковых белков с помощью системы генной пушки BioRad Helios.

При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости использования правильного положительного и отрицательного контроля и знать, что флуоресценция BIFC может быть слабее в сигнале и меньше в количестве флуоресцентных клеток. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.