Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Общая цель следующего эксперимента — анализ экспрессии генов в тканях и на различных стадиях развития изумрудной золановой узкотелой (+) с помощью количественной ПЦР. Это достигается путем препарирования тканей личинок и категоризации стадий развития. На втором этапе из тканей и образцов различных стадий развития экстрагируют РНК с использованием реагента Trizol, который затем используется в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК; после синтеза первой цепи кДНК проводится количественная обратная ПЦР.

Полученные результаты показывают дифференциальную экспрессию целевого гена в различных тканях личинок и на разных стадиях развития на основе данных о кратности изменения, рассчитанных по значениям порогового цикла после количественной R-T-P-C-R амплификации. Здравствуйте, я Пракаш Ми, главный исследователь этой лаборатории на кафедре энтомологии Университета штата Огайо.

Моя лаборатория в основном фокусируется на геномных или молекулярных аспектах взаимодействий между изумрудной узкотелкой, ясенем и возбудителем. Изумрудная узкотелка, или EAB, является экзотическим инвазивным вредителем из Китая, который угрожает самому существованию популяций ясеня по всей Северной Америке. Сегодня мы продемонстрируем вам протокол анализа экспрессии генов у EAB с использованием QPCR или количественной ПЦР в реальном времени.

В данной процедуре принимают участие следующие сотрудники лаборатории: Swapna pri ou, которая выполнит препарирование вала, затем Bin Bandari продемонстрирует выделение RNA, и, наконец, Lauren Rivera Vega проведет анализ QPC. Мы также используем этот метод в нашей лаборатории для изучения экспрессии генов ash.

Итак, приступим. Перед началом данной процедуры поместите личинок изумрудной золановой узкотелой златки (emerald ash B) на влажную бумажную салфетку. До начала проведения диссекции держите свежеприготовленный 1x фосфат-солевой буфер (PBS) на льду, чтобы буфер оставался холодным на протяжении всего процесса препарирования.

Для начала зафиксируйте личинок EAB на диссекционной пластине с помощью тонких энтомологических булавок. Затем добавьте в диссекционную пластину холодный 1×PBS. Сначала обезглавьте личинок с помощью тонких диссекционных ножниц.

Затем с помощью часового пинцета удалите последний абдоминальный сегмент личинок. Отделите кутикулу от тушки личинки, после чего сделайте разрез вдоль всей тушки с помощью ножниц. Будьте осторожны, чтобы не повредить кишечник.

Во время выполнения разреза аккуратно отделите ткань средней кишки от других тканей, таких как жировые тела и соединительная ткань. Затем промойте ткань свежим 1X PBS буфером, чтобы исключить загрязнение жировым телом. Перенесите среднюю кишку в 500 µL предварительно охлажденного реагента TRIzol в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Затем с помощью пинцета изолируйте жировое тело и перенесите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 µL охлажденного реагента TRIzol. В завершение изолируйте ткани кутикулы из трупка личинки, счищая все прилипшие ткани. Будьте осторожны, чтобы не нарушить целостность тканей.

Промойте изолированную ткань кутикулы в свежем буфере PBS и перенесите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 500 µL охлажденного триазольного реагента. Изолированные ткани жирового тела, кутикулы и средней кишки можно хранить при температуре -80 °C до начала экстракции РНК. Перед экстракцией РНК рассортируйте образцы EAB в соответствии с стадиями развития.

Данные стадии включают первую, вторую, третью и четвертую стадии в звездах, PrepU и взрослых особях. Для начала экстракции РНК сначала используйте пластиковые пестики для гомогенизации тканей в пробирках einor объемом 1.5 миллилитра, содержащих triol. После гомогенизации доведите общий объем каждого образца до одного миллилитра с помощью реагента triol.

Для анализа стадий развития гомогенизируйте целое животное в жидком азоте с помощью ступки и пестика. Затем добавьте аликвоту гомогената к одному миллилитру триола. Инкубируйте пробирки с образцами с одним миллилитром триола в течение 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации добавьте в каждую пробирку 200 microliters хлороформа. Интенсивно встряхивайте пробирки в течение примерно 15 секунд. Затем инкубируйте пробирки при комнатной температуре еще две-три минуты.

Затем центрифугируйте образцы при 12 000 g в течение 15 минут при температуре 2 °C. После центрифугирования РНК будет находиться в водной фазе. Объем водной фазы должен составлять 600 µL или 60% от общего объема триола.

Осторожно удалите только водную фазу. Наличие веществ под водной фазой приведет к загрязнению экстрагированной РНК. Затем перенесите водную фазу в соответствующим образом маркированную пробиру объемом 1,5 миллилитра.

Для осаждения РНК из смеси водной фазы добавьте по 0,5 миллилитра изопропилового спирта в каждую пробирку. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации центрифугируйте пробирки при 12 000 Gs в течение 10 минут при температуре двух градусов Цельсия. После центрифугирования удалите S natin из пробирок.

РНК содержится в гелеобразном осадке, образовавшемся на дне пробирки. Промойте осадок 75% этанолом, добавляя не менее 1 мл 75% этанола на каждый 1 мл смеси, предварительно перемешав содержимое на вортексе. Затем центрифугируйте пробирки при 7 500 G в течение пяти минут при температуре 2 °C.

Слейте супернатант из пробирок. Снова центрифугируйте пробирки в малой настольной центрифуге в течение одной минуты. Удалите остатки супернатанта из пробирки с помощью осторожного пипетирования.

Оставьте пробирку открытой и дайте осадку высохнуть на воздухе в течение 5–10 минут. Будьте осторожны, чтобы не пересушить осадок, так как это значительно снизит его растворимость после высушивания на воздухе. Ресуспендируйте осадок в диэтилкарбонате или деионизированной воде.

Количество воды, используемое для ресуспендирования осадка, зависит от его размера. Используйте 50 µL очищенной морской воды для небольшого осадка или 100 µL для крупного осадка. Дайте осадку полностью раствориться в очищенной морской воде, несколько раз перемещая наконечник пипетки вверх и вниз.

После растворения осадка выдержите образец при температуре 55 °C в течение 10 минут. Затем измерьте концентрацию каждого образца РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop. В завершение проведите синтез первой цепи кДНК для соответствующих образцов РНК, используя систему Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System для RT-PCR.

Это описание приведено в текстовой части данного протокола. Для начала разработки количественной ПЦР в реальном времени (Q-R-T-P-C-R) подберите праймеры таким образом, чтобы температура плавления составляла 60 °C, а размер продукта был примерно 100 п. н. В качестве исследуемого гена в данном эксперименте используется AP par one.

Для последующего анализа и нормализации данных необходим референсный ген или внутренний контроль. В данной работе в качестве референсного гена используется белок рибосомальный RPA RRP1. Далее составьте схему, в которой будут указаны названия образцов для каждой лунки и планшета для ПЦР в реальном времени.

Не забудьте добавить стандарты для каждого гена и как минимум две технические повторности для каждого образца. Затем включите прибор для QRT-PCR и введите параметры циклов для настройки планшета на приборе CFX 96. Сначала приготовьте мастер-микс для каждого гена в отдельной пробирке для каждой лунки.

Мастер-микс состоит из 2 µL воды, свободной от нуклеаз, 4 µL SYBR Green 2.5x, 1 µL прямого праймера и 1 µL обратного праймера, что в сумме составляет 8 µL. Согласно ранее разработанному шаблону, добавьте в каждую лунку по 2 µL кДНК. Затем добавьте в каждую лунку по 8 µL мастер-микса, чтобы общий объем одной реакции составил 10 µL. Произведите дозирование вверх-вниз с помощью пипетки, чтобы обеспечить тщательное перемешивание образца.

Убедитесь, что на наконечнике не осталось жидкости. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте новый наконечник для каждого образца. После подготовки всего планшета заклейте его оптической лентой.

Избегайте касаться ленты, так как наличие жира может повлиять на показания. Затем центрифугируйте планшет при 500 RPM в течение одной минуты, чтобы после центрифугирования все продукты в лунках оказались на дне планшета. Убедитесь, что на дне планшета нет льда или воды.

Наконец, поместите планшет в прибор для QR TPCR и запустите программу ПЦР; представлены репрезентативные результаты для личинок EAB. Здесь показаны процессы препарирования и QR TPCR. При препарировании личинки EAB должна обнаружиться средняя кишка в средней части личинки EAB.

Средняя кишка личинки EAB изолируется, как показано здесь; представлены средние значения относительной экспрессии или RAV. Для гена паратрофина AP par one данные приведены для различных тканей личинок, включая кутикулу, среднюю кишку и жировые тела. Специфичный для EAB рибосомальный белок ARP one использовался в качестве внутреннего контроля для нормализации данных, полученных для исследуемого гена.

Относительное изменение кратности экспрессии AP par one было определено для различных тканей личинок. В тканях кутикулы наблюдался наименьший уровень экспрессии, поэтому среднее значение RVs для AP Perry one на разных стадиях развития EAB, включая первую, вторую, третью и четвертую стадии личиночного развития (LAR), было принято за калибровочный образец.

Уровни экспрессии в PrepU и у взрослых особей определяли с использованием aprp one в качестве внутреннего контроля для нормализации данных. Для различных стадий развития определяли относительное изменение кратности экспрессии AP Perry one. В данном случае в образце PrepU наблюдался наименьший уровень мРНК, поэтому он был принят за калибратор.

Мы только что продемонстрировали вам, как выполнять латеральное препарирование и последующий анализ экспрессии генов с использованием латеральных структур, а также различных стадий развития Emeral ra с помощью количественной R-T-P-C-R в ходе данной процедуры. При препарировании следует соблюдать осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов тканей. Также необходимо проявлять внимательность при проведении Q-R-T-P-C-R, чтобы дозировать соответствующие образцы в соответствующие лунки ПЦР-планшета.

На этом всё. Благодарим вас за просмотр нашего видео и желаем успехов в ваших экспериментах.