Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе экспрессии генов в тканях и на стадиях развития изумрудной золановой узкотелой плодожорки с помощью количественной ПЦР. Это достигается путем препарирования тканей личинок и категоризации стадий развития. На втором этапе из тканей и образцов разных стадий развития экстрагируют РНК с использованием реагента Trizol, которая затем используется в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК; после синтеза первой цепи кДНК проводится количественная ОТ-ПЦР.

Получены результаты, демонстрирующие дифференциальную экспрессию целевого гена в различных тканях личинок и на разных стадиях развития, на основании данных об общем изменении, полученных из значений порогового цикла после количественной RT-PCR амплификации. Здравствуйте, я Пракаш Ми, главный исследователь этой лаборатории на кафедре энтомологии Университета штата Огайо.

Моя лаборатория в основном фокусируется на геномных и молекулярных аспектах взаимодействия изумрудной узко beltedly ясеневой зизилии (Emerald Ash Borer, EAB). Изумрудная узко beltedly ясеневая зизилия (EAB) — это опасный инвазивный вредитель из Китая, который угрожает самому существованию популяций ясеня по всей Северной Америке. Сегодня мы продемонстрируем вам протокол анализа экспрессии генов у EAB с использованием qPCR или количественной ПЦР в реальном времени.

В реализации данного протокола будут задействованы следующие сотрудники лаборатории: Свапна Приу, которая выполнит диссекцию, Бин Бандари, которая продемонстрирует выделение RNA, и Лорен Ривера Вега, которая проведет анализ QPC. Мы также используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения экспрессии генов ash.

Приступим к работе. Перед началом данной процедуры поместите личинок изумрудной золадовой узкоплосника (emerald ash B) на влажную бумажную салфетку. До начала диссекции держите свежеприготовленный 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) на льду, чтобы раствор оставался холодным на протяжении всего процесса препарирования.

Для начала зафиксируйте личинок EAB на препарировочной пластине с помощью тонких энтомологических булавок. Затем добавьте на пластину холодный 1x PBS. Сначала удалите голову личинок с помощью тонких препарировочных ножниц.

Затем с помощью часовых пинцетов удалите последний сегмент брюшка личинок. Отделите кутикулу от тушки личинки, после чего сделайте продольный разрез тушки ножницами. Будьте осторожны, чтобы не повредить кишечник.

При выполнении разреза осторожно изолируйте ткани средней кишки от других тканей, таких как жировые тела и соединительная ткань. Затем промойте ткань свежим 1× PBS буфером, чтобы исключить загрязнение жировым телом. Перенесите среднюю кишку в 500 µL предварительно охлажденного реагента TRIzol в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Затем с помощью пинцета изолируйте жировое тело и перенесите его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл охлажденного реагента TRIzol. Наконец, изолируйте ткань кутикулы из трупа личинки, соскребая все прилипшие ткани, стараясь не нарушить целостность ткани.

Промойте выделенную ткань кутикулы в свежем буфере PBS и перенесите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 µL охлажденного реагента тризол. Выделенные ткани жирового тела, кутикулы и средней кишки можно хранить при температуре -80 °C до экстракции РНК. В preparation к экстракции РНК рассортируйте образцы EAB в соответствии со стадиями развития.

Эти стадии включают первую, вторую, третью и четвертую в звездах, PrepU и взрослых особях. Чтобы начать экстракцию РНК, сначала используйте пластиковые пестики для гомогенизации тканей в triol в пробирках einor объемом 1,5 миллилитра. После гомогенизации доведите общий объем каждого образца до одного миллилитра с помощью реагента triol.

Для стадий развития гомогенизируйте целое животное в жидком азоте с помощью ступки и пестика. Затем добавьте аликвоту гомогената в один миллилитр триола. Инкубируйте пробирки с образцами в одном миллилитре триола в течение 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации в каждую пробирку следует добавить 200 µL хлороформа. Тщательно встряхивайте пробирки в течение примерно 15 секунд. Затем инкубируйте пробирки при комнатной температуре еще две-три минуты.

Затем центрифугируйте образцы при 12 000 GS в течение 15 минут при температуре 2 °C. После центрифугирования РНК будет находиться в водной фазе. Объем водной фазы должен составлять 600 µL или 60% от общего объема триола.

Осторожно удалите только водную фазу. Наличие веществ под водной фазой приведет к загрязнению экстрагированной РНК. Затем перенесите водную фазу в соответствующим образом маркированную пробирку типа «эппендорф» объемом 1,5 мл.

Для осаждения РНК из смеси водной фазы добавьте по 0,5 миллилитра изопропилового спирта в каждую пробирку. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации центрифугируйте пробирки при 12 000 Gs в течение 10 минут при температуре двух градусов Цельсия. После центрифугирования удалите S natin из пробирок.

РНК содержится в гелеобразном осадке, образовавшемся на дне пробирки. Промойте осадок 75% ethanol, добавляя не менее одного миллилитра 75% ethanol на один миллилитр образца, перемешав содержимое с помощью вортекса. Затем центрифугируйте пробирки при 7 500 G в течение пяти минут при температуре двух градусов Celsius.

Слейте супернатант из пробирок. Снова центрифугируйте пробирки в малой настольной центрифуге в течение одной минуты. Удалите остатки супернатанта из пробирки с помощью осторожного пипетирования.

Оставьте пробирку открытой и дайте осадку высохнуть на воздухе в течение 5–10 минут. Будьте осторожны и не пересушивайте осадок, так как это значительно снизит его растворимость после высушивания на воздухе. Ресуспендируйте осадок в диэтилперкарбонате или деионизированной воде.

Количество воды, используемое для ресуспендирования осадка, зависит от его размера. Используйте 50 µL очищенной морской воды для небольшого осадка или 100 µL для крупного осадка. Дайте осадку полностью раствориться в очищенной морской воде, несколько раз перемещая наконечник пипетки вверх и вниз.

После растворения осадка выдержите образец при температуре 55 °C в течение 10 минут. Затем измерьте концентрацию каждого образца РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop. В завершение проведите синтез первой цепи кДНК для соответствующих образцов РНК, используя систему синтеза первой цепи Invitrogen SuperScript для RT-PCR.

Эта процедура описана в текстовой части данного протокола. Для начала количественной ПЦР в реальном времени (Q-R-T-P-C-R) разработайте праймеры таким образом, чтобы температура плавления составляла 60 °C, а размер продукта — приблизительно 100 пар оснований. В качестве исследуемого гена в данном эксперименте используется AP par one.

Для последующего анализа и нормализации данных необходим референсный ген или внутренний контроль. В данном случае в качестве референсного гена используется рибосомальный белок a P RRP one. Далее создайте шаблон с указанием названия образца для каждой лунки и QR-пластины для тПЦР.

Не забудьте включить стандарты для каждого гена и как минимум две технические повторности для каждого образца. Затем включите прибор для QRT PCR и введите параметры циклов для настройки планшета в системе CFX 96. Сначала приготовьте мастер-микс для каждого гена в отдельной пробирке для каждой лунки.

Мастер-микс состоит из 2 µL воды, свободной от нуклеаз, 4 µL 2,5x Cyber Green, 1 µL прямого праймера и 1 µL обратного праймера, что в сумме составляет 8 µL. Согласно ранее разработанному шаблону, добавьте в каждую лунку по 2 µL кДНК, затем добавьте в каждую лунку по 8 µL мастер-микса, чтобы итоговый объем одной реакции составил 10 µL. Выполните несколько циклов пипетирования вверх-вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание образца.

Убедитесь, что на наконечнике не осталось жидкости. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте новый наконечник для каждого образца. После подготовки всего планшета заклейте его оптической лентой.

Избегайте прикосновений к ленте, так как наличие жира может повлиять на показания. Затем центрифугируйте планшет при 500 RPM в течение одной минуты, чтобы все продукты в лунках после центрифугирования осели на дно планшета. Убедитесь в отсутствии льда или воды на дне планшета.

В завершение поместите планшет в прибор для QR TPCR и запустите программу ПЦР; представлены репрезентативные результаты для личинок EAB. Здесь показаны процессы диссекции и QR TPCR. При диссекции личинки EAB в средней части тела должна быть видна средняя кишка.

Средняя кишка личинки EAB изолируется, как показано здесь; представлены средние значения относительной экспрессии или RAV. Для паратрофинового гена AP par one данные приведены здесь для различных тканей личинок, включая кутикулу, среднюю кишку и жировые тела. EAB-специфичный рибосомальный белок ARP one использовался в качестве внутреннего контроля для нормализации данных, полученных для исследуемого гена.

Относительное изменение кратности экспрессии AP AP par one было определено для различных тканей личинок. Ткань кутикулы продемонстрировала минимальный уровень экспрессии и, следовательно, была принята в качестве калибровочного среднего значения RVs для AP Perry. One на различных стадиях развития EAB, включая первую, вторую, третью и четвертую стадии личиночного развития (LAR), отмечены звездочками.

Уровни экспрессии в PrepU и у взрослых особей определяли с использованием aprp one в качестве внутреннего контроля для нормализации данных. Для различных стадий развития определяли относительное кратное изменение AP Perry one. В данном случае образец PrepU показал наименьший уровень мРНК и, следовательно, был принят за калибратор.

Мы только что продемонстрировали, как выполнять латеральное препарирование и последующий анализ экспрессии генов в латеральных структурах, а также на различных стадиях развития Emeral ra с использованием количественной ОТ-ПЦР при выполнении данной процедуры. При препарировании следует соблюдать осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов тканей. Также при проведении количественной ОТ-ПЦР необходимо внимательно следить за тем, чтобы соответствующие образцы дозировались в соответствующие лунки ПЦР-планшета.

На этом всё. Благодарим вас за просмотр нашего видео и желаем успехов в ваших экспериментах.