Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио

Общая цель следующего эксперимента — получение изображений нейронных клеток с высоким разрешением. Сначала в эмбрион данио-рерио на стадии одной клетки вводится ДНК, кодирующая мембранно-направленный зеленый флуоресцентный белок, что приводит к мозаичному наследованию и позволяет улучшить визуализацию разрозненных клеток. Затем эмбрионы подвергаются иммуномаркировке антителами к GFP и секционированию, что позволяет с высоким разрешением визуализировать морфологию отдельных клеток в фиксированном препарате. В качестве альтернативы можно исследовать живые эмбрионы с помощью видеомикроскопии в режиме тайм-лапс для изучения клеточной динамики.

Получены результаты, демонстрирующие морфологию или динамику клеток. В данном примере представлено изображение заднего мозга рыбки-зебра, полученное с помощью конфокальной микроскопии. Всем привет.

Я — П. Р. Чандран из лаборатории доктора Рэйчел Брюстер с кафедры биологических наук Университета Мэриленда в Балтиморском округе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру маркирования и визуализации нейронных клеток в эмбрионе данио-рерио с высоким разрешением. Обычно мы используем этот метод в лаборатории для изучения механизмов нейронной регенерации в эмбрионе данио-рерио на клеточном уровне.

Итак, приступим. Разместите влажные салфетки Kim wipes по краю чашки Петри диаметром 100 мм.

Осторожно закрепите стеклянную иглу для микроинъекций на полоске воска внутри увлажненного чашки. Под диссекционным стереомикроскопом выровняйте иглу относительно градуированного предметного стекла. Чтобы получить кончик подходящего размера, аккуратно постучите по игле чистым лезвием бритвы в месте, где её диаметр составляет 1 µm.

Подсоедините иглу к аппарату для микроинъекций. Нанесите 0,5 µL раствора фенолового красного в воде на парафильм и заполните иглу из капель. Установите давление микроинъекции на 7 kPa и начните с импульса длительностью 20 ms. Подсчитайте количество импульсов, необходимых для выведения всей жидкости. Подберите время в диапазоне от 10 до 30 ms таким образом, чтобы на выведение жидкости требовалось примерно 250 импульсов.

0,5 мкл раствора. С помощью микропипетки заполните иглу в обратном направлении от 0,5 до 1 мкл MG FPD NA в воде, смешанной с феноловым красным для визуализации. Накройте увлажненную чашку, чтобы предотвратить испарение раствора из иглы под стереомикроскопом.

Поместите эмбрионы рыб на стадии одной клетки в чашку Петри диаметром 60 мм, заполненную средой для эмбрионов (Embryo Medium). С помощью тонкого пинцета аккуратно захватите хорион и зафиксируйте эмбрион. Подведите иглу, заполненную MGFP и феноловым красным, к целевой области для инъекции.

Для обеспечения экспрессии MGFP в широком диапазоне вводите раствор в желток или цитоплазму. Используйте аппарат для микроинъекций, чтобы ввести примерно две нанолитров раствора MGFP. Следите за положением индикатора фенолового красного, чтобы подтвердить правильность введения.

Осторожно извлеките иглу из эмбриона. Введите препарат всем эмбрионам в чашке, до 30 эмбрионов за один раз. Избегайте воздействия света на эмбрионы; инкубируйте их при температуре 28.5 °C под стереомикроскопом до достижения ими нужной стадии развития.

С помощью тонкого пинцета осторожно снимите хорион с эмбрионов. Используйте пастевскую пипетку, чтобы удалить пустые оболочки хориона из чашки, оставив только эмбрионы, покрытые DEC. Используя пастевскую пипетку с оплавленным концом, перенесите инъецированные покрытые эмбрионы в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter.

Удалите как можно больше излишков среды, затем добавьте один миллилитр ative. Промойте эмбрионы в 1X PBS при комнатной температуре три раза по пять минут. Перенесите эмбрионы в чашку Петри с 1X PBS под стереомикроскопом.

Используйте тонкий пинцет, чтобы удерживать эмбрион в области хвоста. С помощью второго пинцета или зонда постарайтесь удалить как можно больше желтка, не касаясь области задней рамы. Под стереомикроскопом с помощью тонкого пинцета перенесите эмбрион из чашки в форму для секционирования, заполненную 4% низкоплавким agarose.

Расположите эмбрион ближе к одному из концов формы. Дайте агарозе затвердеть при комнатной температуре. С помощью шпателя извлеките затвердевший блок агарозы из формы и с помощью лезвия бритвы ровно срежьте нижний конец блока.

При желании закрепите блок на платформе вибратора срезом вниз, используя каплю суперклея. Расположите несколько блоков на платформе. Прикрепите платформу к вибратору.

Убедитесь, что лезвие разрезает каждый эмбрион насквозь, но не прорезает блок полностью. Заполните предметный столик одним раствором XPBS. Осторожно срежьте эмбрионы с задней части блока и перенесите их в чашку Петри, наполненную раствором XPBS.

Разделите срезы под стереомикроскопом. С помощью тонкого пинцета перенесите нужные срезы в многолуночный планшет, заполненный 1X PBS. Для каждого эмбриона используйте отдельную лунку.

Окрасьте срезы с помощью DPI и проведите иммуномаркировку антителами к GFP. В противном случае визуализацию следует провести в течение 48 часов. Поместите до шести срезов на одно предметное стекло и накройте их покровным стеклом для конфокальной микроскопии.

Храните предметные стекла в темноте, чтобы избежать фотовыцветания. При живой визуализации эмбрионы, в которые ввели MGFP, должны быть защищены от света. Используйте пинцет, чтобы извлечь эмбрионы за 30 минут до достижения ими нужной стадии развития.

Перенесите покрытые эмбрионы в седационный раствор среды для эмбрионов с 0,01% Trica и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Пипеткой нанесите каплю 1% обычного агароза в воде на культуральную чашку с стеклянным дном диаметром 35 мм так, чтобы раствор заполнил форму. Дайте агарозе затвердеть.

Используя стеклянную капиллярную трубку длиной 90 мм, сделайте три отверстия в капле aros под стереомикроскопом. Осмотрите дно лунки и удалите остатки aros с помощью пинцета. Заполните чашку средой для эмбрионов под стереомикроскопом.

С помощью паста-пипетки перенесите по одному эмбриону в каждое отверстие в арос. Используя тонкий пинцет, ориентируйте эмбрион так, чтобы интересующая область (в данном случае дорсальная часть головы) прилегала к стеклу. Накройте чашку крышкой.

Осторожно перенесите чашку на предметный столик конфокального микроскопа. Используйте нагреватели, чтобы поддерживать температуру эмбрионов на уровне 28.5 °C на протяжении всего процесса визуализации. Здесь представлен срез заднего мозга эмбриона дикого типа на стадии 4–5 сомитов с двойным мечением: мембранно-ориентированным GFP (зеленый цвет) и D (синий цвет); только одна клетка мечена мембранно-связанным GFP, что позволяет проводить визуализацию морфологии и организации клеток с высоким разрешением.

На данном сравнительном изображении представлен задний мозг мутанта nardi на стадии от четырех до пяти сомитов. Это изображение показывает, что клетки у мутантов nardi не ориентируются должным образом по отношению к средней линии в процессе нейроревелации. В отличие от метода маркировки клеток с помощью MGFP, мечение заднего мозга общим маркером клеточной поверхности, таким как бета-катенин, не позволяет визуализировать морфологию отдельных клеток.

Таймлапс-визуализация заднего мозга эмбриона, меченного MG FP, показывает, что клеточные механизмы, определяющие нейрорелацию у данио-рерио, весьма динамичны и включают вытягивание мембранных выростов по мере миграции и интеркаляции клеток. Мы только что продемонстрировали вам способы подготовки как фиксированных, так и живых эмбрионов данио-рерио для одноклеточной визуализации с высоким разрешением. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.