Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио

В эмбрионе рыбы данио сначала зеленый флуоресцентный белок, кодирующий ДНК, вводится в эмбрион рыбы данио, что приводит к мозаичному наследованию, тем самым обеспечивая улучшенную визуализацию рассеянных клеток. Затем эмбрионы мечаются иммунометкой с помощью анти-GFP и секционируются, что позволяет визуализировать морфологию отдельных клеток с высоким разрешением в фиксированном препарате. В качестве альтернативы живые эмбрионы могут быть исследованы с помощью покадровой видеомикроскопии для визуализации клеточной динамики.

Получены результаты, которые показывают морфологию или динамику клеток. Здесь задний мозг данио-рерио визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. Всем привет.

Я PR Чандран из лаборатории доктора Рэйчел Брюстер на факультете биологических наук Университета штата Мэриленд, округ Балтимор. Сегодня мы покажем вам процедуру маркировки и визуализации нервных клеток в эмбрионе данио-рерио в более высоком разрешении. Обычно мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения механизмов нейроотношений у эмбриона рыбы данио на клеточном уровне.

Итак, приступим. Поместите во влажное место. Ким вытирает край 100-миллиметровой чашки Петри.

Тщательно закрепите стеклянную иглу для микроинъекций на полоске воска внутри увлажненной посуды. Под анализирующим стереомикроскопом выровняйте иглу относительно градуированного предметного стекла. Чтобы получить наконечник соответствующего размера, с помощью чистого лезвия бритвы аккуратно постучите по игле в том месте, где ее диаметр составляет один микрометр.

Подсоедините иглу к микроинъекционному аппарату пипеткой 0,5 микролитра раствора фенолового красного и воды на пара-пленку и спереди заполните иглу от капель. Установите давление микровпрыска на семь килопаскаль и начните с 20-миллисекундного импульса. Варьируйте время от 10 до 30 миллисекунд так, чтобы для выдачи потребовалось примерно 250 импульсов.

0,5 микролитра раствора. С помощью микропипетки засыпьте иглу от 0,5 до одного микролитра мг FPD NA в воду, смешанную с феноловым красным Для визуализации. Накройте увлажненную посуду крышкой, чтобы предотвратить испарение раствора из иглы под стереомикроскопом.

Поместите одну клеточную стадию отдельных эмбрионов рыбы в 60-миллиметровую чашку Петри, заполненную эмбрионами. Терпимая. С помощью тонких щипцов аккуратно захватите кориан и стабилизируйте эмбрион. Переместите иглу, наполненную MGFP и феноловым красным, в целевую область для инъекции.

Для широкого диапазона экспрессии MGFP вводите в желток или цитоплазму. Используйте аппарат для микровпрыска для подачи примерно двух нанолитров раствора MGFP. Следите за расположением красного индикатора фенола, чтобы подтвердить правильность инъекции.

Аккуратно извлеките иглу из эмбриона. Введите в чашку все эмбрионы до 30 эмбрионов за один раз. Избегайте воздействия света на эмбрионы, инкубируйте при температуре 28,5 градусов Цельсия, чтобы позволить эмбрионам развиться до желаемой стадии под стереомикроскопом.

С помощью тонких щипцов аккуратно снимите кориан с эмбрионов. С помощью пипетки для пасты удалите пустой кориан из формы, оставив только эмбрионы, покрытые оболочкой. Используйте отполированную огнем пипетку для макарон, чтобы перенести введенные эмбрионы, покрытые оболочкой, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Удалите как можно больше лишней среды, затем добавьте один миллилитр натива. Промойте эмбрионы при комнатной температуре по одному XPB S3 раза по пять минут каждый. Переместите эмбрионы в чашку Петри, заполненную одним XPBS под стереомикроскопом.

Используйте тонкие щипцы, чтобы удерживать эмбрион возле области хвоста. Используйте второй набор щипцов или кочергу, чтобы попытаться удалить как можно больше щипцов, не касаясь области заднего каркаса. Глядя под стереомикроскоп, с помощью тонких щипцов вытащите эмбрион из чашки в форму для секционирования, заполненную температурой плавления на 4%. Арос.

Расположите эмбрион ближе к одному концу формы. Дайте аросу застыть при комнатной температуре. С помощью шпателя извлеките затвердевший блок из формы с поднятием лезвия, срежьте нижний конец блока равномерно.

Используйте каплю суперклея, чтобы прикрепить блок к сцене вибрато, вырезанной стороной вниз, если это необходимо. Выровняйте несколько блоков в рабочей области. Присоедините сцену к вибрато.

Убедитесь, что лезвие будет разрезать каждый зародыш полностью, но не полностью блок. Заполните сцену одним разделом XPBS. Эмбрионы аккуратно разрезают на задней стороне одного блока ару и переносят его в чашку Петри, заполненную одним XPBS.

Разделите срезы под стереомикроскопом. С помощью тонких щипцов поместите нужные срезы в многолуночную чашку, заполненную одним XPBS. Используйте разную лунку для каждого эмбриона.

Покрасьте срезы DPI и иммунометку анти-GFP. Если нет, визуализация в течение 48 часов. Установите до шести секций на предметное стекло и поместите крышку поверх секций для конфокальной визуализации.

Храните слайды в темноте, чтобы избежать фотообесцвечивания. Живая визуализация, инъекционные эмбрионы MGFP должны быть защищены от света. Используйте щипцы для покрытия эмбрионов за 30 минут до того, как они достигнут желаемой стадии развития.

Перенесите покрытые оболочкой эмбрионы в седативный раствор эмбриональной среды с 0,01%-ной трикой, инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Пипетка каплей на 1% регулярно поднимается в воду на 35-миллиметровом стеклянном дне чашки для культуры так, чтобы она заполнила форму. Дайте агросу застыть.

С помощью 90-миллиметровой стеклянной капиллярной трубки проделайте три отверстия в капле ароса под стереомикроскопом. Осмотрите дно лунки и удалите остатки щипцами. Наполните чашку эмбриональной средой под стереомикроскопом.

С помощью пипетки для пасты перенесите по одному эмбриону в каждое отверстие в аросе. С помощью тонких щипцов сориентируйте эмбрион так, чтобы интересующая область в данном случае спинная головка упиралась в стекло. Накройте блюдо крышкой.

Аккуратно транспортируйте чашку к столику конфокального микроскопа. Используйте обогреватели, чтобы поддерживать температуру эмбрионов при температуре 28,5 градусов Цельсия на протяжении всей визуализации. Вот разрез через задний мозг эмбриона дикого типа на четырех-пяти сомитах, дважды помеченных мембранным целевым GFP зеленым цветом и D синим, только одна клетка помечена мембранным GFP, что позволяет получить изображение клеточной морфологии и организации с высоким разрешением.

Это сопоставимое изображение заднего мозга мутанта нарди дин с точностью до пяти сомитов. Это изображение показывает, что клетки нарди и мутантов не могут правильно ориентироваться по направлению к средней линии во время нейрораскрытия. В отличие от метода маркировки клеток с помощью MGFP, мечение заднего мозга маркером общей клеточной поверхности, таким как бета-катенин, не позволяет визуализировать морфологию отдельных клеток.

Покадровая визуализация заднего мозга меченого MG FP эмбриона показывает, что поведение клеток, которое управляет нейроотношениями у рыб данио, очень динамично и включает в себя расширение мембранных выступов по мере миграции и объединения клеток. Мы только что показали вам, как подготовить как неподвижные, так и живые эмбрионы рыб данио для визуализации одиночных клеток с высоким разрешением. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.