Флэш Замораживание и Cryosectioning E12.5 мозга мыши

Здравствуйте, я Спенсер Керли из лаборатории Эда Маки в Калифорнийском университете в Ирвине, и я продемонстрирую, как выполнять криосекционирование. Для этого я сначала использую следующие распространенные реагенты. Соединение или среда для заливки, которую я использую, называется OCT (optimal cutting temperature — оптимальная температура резания).

Это прозрачный раствор, он очень густой и вязкий, что позволяет надежно фиксировать ткань, пока вы ее ориентируете, после чего он замерзает; в конечном итоге он растворим в воде, поэтому его можно удалить при любой процедуре окрашивания. Я заливаю ткань в форму. Эти контейнеры для биопсии с криоформами бывают разных размеров.

Я буду использовать эту форму меньшего размера, так как работаю с эмбриональной тканью мыши. Мы подвергаем наши ткани мгновенной заморозке в жидком азоте. Сначала я наполню эту защитную вакуумную колбу жидким азотом из нашего резервуара.

Перед шоковой заморозкой ткани необходимо провести процедуру, называемую криопротекцией, иначе сама заморозка разрушит структуру ткани. Для этого погрузите ткань в 30% раствор сахарозы на ночь. Если потребуется больше времени, это допустимо, главное, чтобы ткань полностью погрузилась в раствор.

Как видите, головы мышей на стадии эмбрионального развития 12,5 погрузились в раствор сахарозы, и теперь их можно замораживать. Сейчас я просто перелью ткани из раствора сахарозы в блюдце большего размера, чтобы мне было удобнее с ними работать. Я возьму немного состава OCT и налью его в это блюдце диаметром 35 мм, которое установлено на крышку, чтобы поверхность была под наклоном.

Таким образом, OCT скапливается вдоль края для обеспечения глубины. Я использую пару старых затупленных пинцетов, так как они не должны быть острыми, и я не хочу испортить еще одну пару пинцетов. Я беру их, очень осторожно поднимаю одну из этих головок и помещаю ее в первую ванночку с OCT.

Я хочу покрыть эмбрион составом OCT. Это обеспечивает более качественное и равномерное замораживание ткани. Необходимо убедиться в отсутствии остатков сахарозы вокруг ткани или пузырьков воздуха.

Обязательно избегайте появления пузырьков воздуха. Поэтому я осторожно перемешиваю OCT вокруг и под головкой, перемещая головку в OCT и оставляя ее там на несколько секунд, пока заполняю криоформу. Теперь я заполню криоформу OCT, снова стараясь избегать пузырьков.

Теперь я просто заполню форму до самого верха. Как вы заметили, я промаркировал форму, поэтому я смогу определить ее ориентацию после замораживания.

При замерзании OCT-компаунд становится белым, и ткани больше не видно. Поэтому обязательно подпишите криоформу перманентным маркером.

У меня действительно образовался пузырек воздуха в OCT, поэтому я использую пинцет, чтобы просто вытолкнуть его за край. Не следует допускать, чтобы это мешало заморозке ткани. Теперь я перенесу голову из этой чашки в OCT, находящийся в моей форме.

Я просто аккуратно извлеку образец из чашки и помещу его в форму. Затем я перейду к микроскопу, чтобы правильно ориентировать ткань. Теперь ткань находится в моей криоформе, и я посмотрю через микроскоп, чтобы задать ей нужное направление.

Я буду делать корональные срезы этой головы мыши. Поэтому мне нужно сориентировать её так, чтобы правильно расположить в криостате для выполнения корональных срезов. Снова использую эти старые тупые пинцеты; как видите, здесь появились пузырьки воздуха, и я постараюсь максимально их удалить.

Но эти мелкие пузырьки не представляют проблемы. Я не заметил никаких негативных последствий от этих мелких пузырьков. Главное — избегать образования крупных пузырьков.

Поэтому я просто постараюсь максимально аккуратно сдвинуть их, при этом обязательно буду часто протирать пинцет, так как это помогает лучше избежать появления пузырьков. Теперь, если вы видите мою маркировку, здесь вверху у меня буква Т, а слева — буква F. Это указывает мне на то, что верхняя часть головы будет направлена вверх, а передняя часть или лицо — влево.

Таким образом я знаю, по какой поверхности делать срезы для получения корональных сечений, и просто слегка сдвигаю ткань. Опять же, иногда при этом образуются пузырьки, и их нужно вытеснить, чтобы они не замерзли вместе с тканью. Наличие пузырьков крайне нежелательно, прежде всего потому, что при замораживании они могут привести к неравномерному замерзанию ткани.

Цель экспресс-замораживания заключается в том, чтобы все ткани замерзли одновременно. Кроме того, при срезании ткани в криостате, если лезвие проходит через пузырек воздуха, а не через OCT или ткань, это может привести к зацепу или разрыву, что может повредить или разрушить ваш образец. Поэтому крайне важно любой ценой избегать появления таких пузырьков.

Особенно более крупные. Поэтому я все еще ориентирую его здесь. Эта ткань фиксировалась в течение 24 часов, поэтому она достаточно устойчива к моим манипуляциям.

Другие ткани могут быть более мягкими, поэтому следует действовать очень осторожно. После того как я расположил образец под микроскопом лицом влево и макушкой вверх, мне необходимо убедиться в правильности его ориентации и в других плоскостях. Поэтому я приподниму его и осмотрю все грани куба, чтобы убедиться, что положение верно.

Я вижу, что он немного наклонен вниз, поэтому мне нужно просто приподнять его пинцетом. Хорошо? Этому определенно требуется много практики. Итак, выглядит хорошо.

Теперь я перейду сюда и заморожу образец в жидком азоте. Теперь, когда ткань правильно ориентирована в криоформе, я залью жидкий азот в эту чашку. Это обычная пластиковая чашка Петри для культивирования тканей; заполняю её до самого верха.

Оно испаряется довольно быстро. Сейчас я возьму пинцет и опущу криоформу. Как видите, я немного подогнул нижний край.

Это определенно обеспечивает гораздо более удобную работу с образцом. Я собираюсь заморозить его. По мере замерзания ткани и OCT смесь становится плотной и белой.

Как только процесс завершится, образец станет полностью белым. После этого мне нужно быстро поместить замороженную ткань в морозильник при -80 °C для хранения. Держите образец так, чтобы ткань не была полностью погружена в среду.

Поэтому нужно быть очень осторожным и удерживать образец непосредственно на поверхности жидкого азота. Теперь он заморожен. Подержите его там еще несколько секунд, прежде чем я перенесу его в морозильник при -80 °C.

Теперь я перенесу образец в морозильник при температуре -80 °C. Я достал ткань из морозильника (-80 °C) и поместил ее в этот криостат. Температура в камере составляет -24 °C.

Сейчас необходимо дать ткани стабилизироваться в течение примерно от получаса до одного часа, прежде чем можно будет приступать к серийному срезанию. В противном случае она будет слишком хрупкой. Поскольку все криостаты различаются, я просто укажу на некоторые основные особенности данного прибора.

Мы используем криостат Leica CM 30 50 s. Это отличный прибор, так как он оснащен отдельным блоком охлаждения самого образца, что является значительным преимуществом. Можно задать температуру образца, поскольку для среза различных типов тканей требуются разные температурные режимы.

Таким образом, при первой загрузке ткани необходимо выполнить несколько настроек. Они схожи на всех криостатах: некоторые регулируются электронно, другие — вручную.

Например, вам потребуется отодвинуть рычаг криостата или продвинуть его вперед, чтобы расположить образец дальше от ножа или ближе к нему. Это можно сделать быстро или медленно. Толщину среза можно настроить с помощью этих кнопок «плюс» или «минус» здесь.

Затем вы выберете между обрезкой или толщиной среза, что указывается на этой средней кнопке. Температуру камеры или самого образца рядом с этим цифровым дисплеем можно установить, просто нажав сюда и используя стрелки вверх или вниз для регулировки температуры. В нашем случае при проведении криосекционирования мы используем предметные стекла Superfrost Plus марки Fisher.

Они покрыты адгезивом, чтобы ткань не отслаивалась в процессе обработки. Иногда при срезании можно заметить, что ткань кажется слишком мягкой; признаком этого является ее сминание при соприкосновении с лезвием. Для решения этой проблемы можно использовать средство Fisher brand super friendly freeze.

Этот прибор обеспечивает мгновенное замораживание ткани: достаточно направить его на образец и нажать на спусковой крючок, и ткань быстро подморозится, если она окажется слишком мягкой. Прежде чем закрепить ткань на предметном столике для секционирования, я кратко ознакомлю вас с устройством данного аппарата. Вот здесь устанавливается нож, который фиксируется этой металлической пластиной.

Подняв этот рычаг, вы сможете снять и заменить лезвие по мере необходимости. Убедитесь, что оно надежно закреплено. Не затягивайте крепление лезвия слишком сильно, иначе оно может деформироваться.

Вы заметите при сечении, что толщина ткани неодинакова. Поэтому не следует опускать этот рычаг до самого конца. Его нужно привести в положение, когда он находится примерно на одном уровне с самим лезвием.

Это еще один элемент, который может потребоваться отрегулировать во время микротомии. Он называется антироликовой пластиной. Это стеклянная пластина, которая вставляется в данный держатель и регулируется с помощью этого подпружиненного винта.

Вы можете перемещать его вперед или назад; это позволит поддерживать ткань или срезы плоскими, чтобы их можно было закрепить на предметном стекле. Еще один параметр, который может потребоваться отрегулировать во время изготовления срезов, — это участок лезвия, непосредственно осуществляющий резку.

Чтобы произвести такую регулировку, просто поднимите этот рычаг, после чего все устройство можно будет перемещать влево или вправо. Это необходимо делать только в том случае, если вы заметили, что ткань зацепляется за определенную часть лезвия, или если вы хотите сберечь лезвия, так как они довольно дороги. Таким образом, вы можете найти чистый участок лезвия, перемещая устройство вперед и назад.

Еще один параметр, который можно отрегулировать, — это угол реза. Сбоку здесь расположены три различных положения, которые не будут видны. Мы используем среднее положение; регулировка осуществляется путем поднятия другого рычага.

Также эту конструкцию можно перемещать вверх и вниз. Мы всегда держим ее посередине, поэтому я оставлю ее в этом положении.

Вот здесь находится головка криостата. Она удерживает замороженный образец ткани в процессе нарезки. Головка перемещается вверх-вниз и продвигается в сторону ножа.

По сути, вы закрепляете ткань на этом зажимном устройстве, затем помещаете его в головку, затягиваете и с помощью этих ручек сзади регулируете угол, чтобы срез был более ровным. Сейчас я закреплю ткань на зажимном устройстве. Рекомендуется держать зажимные устройства при комнатной температуре, так как сначала вы наносите слой OCT, и он не должен замерзнуть мгновенно — слой должен быть ровным и плоским.

И мы будем использовать это устройство, оно называется теплоотвод. На самом деле, оно будет использоваться для того, чтобы OCT оставался плоским в процессе замораживания. Первым делом я беру блок при комнатной температуре и помещаю его в этот держатель.

Возьмите немного моих пузырьков OCT. Здесь это не имеет значения, так как они будут выдавлены. Просто добавьте немного, много не потребуется.

Возьмите теплоотвод и установите его точно в этом месте. Подождите несколько секунд. После этого вы увидите, что OCT лежит ровным слоем.

Теперь, когда ткань готова, мне нужно отметить сам OCT. Хорошо, я отмечу точку на OCT, чтобы указать его положение. Вот так, я отметил верхнюю часть синей точкой.

Теперь я извлеку блок ткани из формы, просто надавив на её заднюю часть. Я аккуратно нажму сзади, чтобы вытолкнуть блок в руку, но, опять же, я не хочу, чтобы он разморозился, поэтому сразу помещу его обратно.

Теперь вы видите блок ткани с синей меткой, которую я сделал. Таким образом, я знаю, где находится верхняя часть головы эмбриона. Мне необходимо выполнить срезы через область лица, так как это будут корональные сечения.

Теперь я добавлю еще одну большую каплю OCT; мне нужно действовать быстро, так как все компоненты холодные. Я возьму ткань и помещу ее точно в центр, убедившись, что она плотно прилегает к уже сформированному слою OCT. Теперь я дам образцу замерзнуть, это займет примерно одну или две минуты.

Замораживание завершено. Теперь я возьму ткань, закрепленную на чашке, помещу ее в патрон, максимально выровняю и затем затяну. Она должна быть надежно зафиксирована.

Я помещу его непосредственно перед лезвием, а затем буду продвигать, что может занять несколько секунд. Теперь я воспользуюсь плоским краем лезвия для точного позиционирования ткани. Я просто посмотрю на край и буду перемещать ткань вверх и вниз, чтобы убедиться, что края совпадают.

Если этого не сделать, то, знаете, это может выглядеть примерно так. Очевидно, что я преувеличиваю, но здесь видно, что оно прилегает не ровно к лезвию. Поэтому я продолжаю вносить корректировки до тех пор, пока не почувствую, что оно установлено максимально ровно.

Я считаю, что это вполне приемлемо. Поэтому я осматриваю образец со всех сторон, чтобы убедиться, что ткань будет обрезана прямо по лезвию, и использую край лезвия в качестве ориентира. Я смотрю сверху и сбоку, и, по сути, ткань выглядит вполне подходяще.

Мне не приходится делать много настроек, но если бы это потребовалось, я бы просто воспользовался ручками, расположенными на задней части головки. Поворачивая их влево или вправо, можно выполнять точную настройку. Но сейчас все выглядит вполне хорошо.

Сейчас я продвигаю ткань. Среза еще не происходит, так как ткань еще не соприкасается с лезвием; она глубоко погружена в ОСТ.

Таким образом, достижение ткани может занять несколько минут. Не следует двигаться слишком быстро, так как это может привести к зацепу и растрескиванию OCT и ткани, но также не стоит двигаться слишком медленно, чтобы процесс не затянулся на неопределенный срок. В данном аппарате есть полезная функция обрезки более толстым срезом, что позволяет увеличить скорость работы.

Итак, сейчас я фактически прорезаю OCT-соединение, поэтому я немного замедляюсь. Я всё еще не добрался до ткани, но именно в этот момент я оцениваю, как будет проходить процесс получения срезов. Множество переменных могут повлиять на то, насколько успешно или неудачно пройдет секционирование ткани.

Я заметил, что при работе с этим криостатом чаще всего возникает проблема в том, что ткань оказывается слишком холодной. Я снижал температуру, но она все равно кажется избыточно низкой. В результате лезвие начинает вибрировать при разрезании ткани или OCT-компаунда.

В результате на срезах OCT появляются такие мелкие горизонтальные линии. В таких случаях я просто слегка прогреваю край OCT большим пальцем, осторожно касаясь его и проводя пальцем в течение короткого времени. Затем, при изготовлении срезов, я заметил, что качество значительно улучшается, а эффект «дробления» исчезает.

Таким образом, именно эти моменты я оцениваю перед началом работы с тканью. Я заметил, что при прохождении лезвия через ткань в OCT-компаунде возникает зацеп или, фактически, трещина. Поэтому первым делом я заменяю лезвие.

Я не уверен, как давно здесь установлено это лезвие и кто пользовался им до меня, поэтому я просто возьму новое лезвие. Очевидно, что они очень острые, поэтому нужно быть осторожным. Теперь я отрегулирую антироликовую пластину; в нижней части здесь есть подпружиненный винт, который нужно задействовать снизу, чтобы переместить пластину внутрь или наружу.

Я произвел достаточное количество срезов, чтобы добраться до ткани. К сожалению, в блоке OCT появилась трещина; это случается часто, и, к сожалению, полностью контролировать этот процесс невозможно, однако существуют способы её устранения. Если бы трещина прошла через ткань, образец пришлось бы выбросить или попытаться спасти то, что возможно.

В данном случае трещина, похоже, находится над тканью. Поэтому я возьму лезвие бритвы, которое находилось в криостате. Оно охлаждено.

Я постараюсь просто срезать треснувшую часть, которая находится в верхней части блока OCT. Итак, снова я воспользуюсь большим пальцем, чтобы нагреть поверхность блока OCT. Затем я сделаю срез, и, как вы видите, здесь есть трещина.

Затем я отделил фрагмент с тканью, а остальную часть OCT просто отбросил — это была растрескавшаяся часть. Теперь я попробую обрезать этот растрескавшийся участок с помощью охлажденного лезвия бритвы. Мне нужно двигаться строго прямо, используя обе руки, чтобы равномерно нажимать на лезвие.

Теперь я буду совершать раскачивающие движения лезвием в OCT-блоке. Я аккуратно перемещаю лезвие вперед и назад, медленно срезая слой OCT. Надеюсь, мне удастся удалить треснувшую часть.

Хорошо, теперь я удалю излишки OCT. Так, выглядит хорошо. Теперь я немного отведу голову назад, так как в процессе получились края, которые могут зацепить лезвие; если это произойдет, OCT и ткань могут отслоиться, что испортит мой образец.

Итак, я отвел инструмент, поэтому теперь мне нужно продвинуться немного вперед, чтобы снова войти в ткань; надеюсь, мне удалось устранить трещину. Хорошо, теперь я снова вхожу в ткань. Похоже, мне действительно удалось ее устранить.

Таким образом, в OCT больше нет никаких трещин, что значительно облегчит получение срезов. Теперь я перехожу к той части ткани, которая меня интересует. В данный момент я только касаюсь поверхности и хочу добраться до головного мозга этого эмбриона.

Они достаточно велики, чтобы я мог видеть структуры, которые меня интересуют. Я забыл упомянуть, что использую эти кисти для очистки лезвия между каждым срезом, который мне нужно зафиксировать. Эта большая кисть предназначена только для очистки области и удаления излишков OCT.

Я также использую эти тонкие кисти, чтобы перемещать срез по этой охлажденной пластине и точно позиционировать его при захвате. Эти кисти также поддерживаются в охлажденном состоянии, чтобы OCT не таял и не прилипал к ним. Чтобы захватить ткань, я сначала прогрею OCT и ткань большим пальцем.

Я возьму один из этих уже промаркированных предметных стекол. Я держу его перевернутым; каждый делает это по-своему, но мне удобнее держать правый верхний угол правой рукой, когда стекло обращено вниз.

Затем я использую большой палец левой руки в качестве точки опоры, чтобы опустить предметное стекло строго вертикально к блоку и захватить срез. ОКТ и ткань фактически расплавятся на стекле и зафиксируются сами. Поэтому сначала я медленно прогрею ткань большим пальцем, сделаю срез, возьму предметное стекло, зажму правый угол правой рукой, перемещу блок, опущу его строго вертикально и дам срезу приплавиться.

Я осмотрю ткань, чтобы убедиться в отсутствии складок или пузырьков и в том, что образец выглядит подходящим. Я буду продолжать этот процесс до тех пор, пока не разделю весь мозг на срезы. Сейчас я изучаю срезы под диссекционным микроскопом, чтобы убедиться в их качестве; всё в порядке, в верхней части среза виден передний мозг, и все они выглядят очень хорошо.

Эти криосрезы можно использовать для таких процедур, как гибридизация in situ. Иногда мы выполняем базовые гистологические исследования, например, окрашивание гематоксилином и эозином. Также можно проводить иммунофлуоресцентный анализ и ряд подобных исследований.

Что касается меня, то эти срезы были фиксированы и обработаны для гибридизации in situ. Именно этим я и займусь далее.