Флэш Замораживание и Cryosectioning E12.5 мозга мыши

Здравствуйте, я Спенсер Керли из Калифорнийского университета в Ирвайне и лаборатории Эда Маки, и я собираюсь продемонстрировать, как проводить криосекцию. Для этого я сначала использую эти часто используемые реагенты. Закладочный компаунд или закладная среда, которую я использую, называется OCT для оптимальной температуры резки.

Это прозрачный раствор, он очень густой и вязкий, и он хорошо удерживает ткань, пока вы можете ориентировать ее, а затем она замерзает, и, в конечном счете, она растворима в воде, поэтому вы можете избавиться от нее во время любой процедуры окрашивания. Поэтому я вставляю ткань в форму. Эти контейнеры для биопсии криоформы бывают разных размеров.

Я буду использовать эту меньшую форму, потому что я делаю эмбриональную ткань мыши. Мы мгновенно замораживаем наши ткани и жидкий азот. Итак, сначала я собираюсь наполнить эту защитную вакуумную колбу жидким азотом из нашего бака.

Перед мгновенной заморозкой ткани вы должны так называемым крио защитить ткань, иначе само замораживание разрушит ткань. Итак, что вы делаете, так это погружаете ткань в 30% раствор сахарозы на ночь. А если это занимает больше времени, ничего страшного, главное, пока ткань опускается.

И как видите, за 12,5 день эмбриона мышиные головки, уже погрузились в раствор сахарозы, поэтому они готовы к заморозке. Теперь я просто высыплю ткань, которая находится в растворе сахарозы, в большую чашку, чтобы я мог манипулировать тканью. Я собираюсь взять немного этого ОКТ и вылить его в эту 35-миллиметровую тарелку, которая на самом деле лежит на крышке, чтобы я мог достать ее под углом.

Таким образом, ОКТ скапливается вдоль края для глубины. Поэтому я использую пару старых притупленных щипцов просто потому, что они не нужны острыми, и вы не хотите испортить еще одну пару щипцов. Итак, я беру их, очень осторожно поднимаю одну из этих головок и помещаю ее в эту первую ванну ОКТ.

Я просто хочу покрыть эмбрион ОКТ. Это позволяет для лучшего, более равномерного замораживания тканей. Вы не хотите, чтобы вокруг ткани оставалась сахароза или пузырьки воздуха.

Обязательно избегайте пузырьков воздуха. Поэтому я просто осторожно перемешиваю ОКТ вокруг и под головкой, перемещаю головку через ОКТ и оставляю ее там всего на несколько секунд, пока я заполняю свою криоформу. Итак, теперь я собираюсь заполнить криоформу ОКТ, опять же, избегая образования пузырей.

И я просто собираюсь заполнить его до верха формы. И, как вы заметите, я пометил плесень. Так что я смогу, я смогу видеть свою ориентацию после того, как она замерзнет.

Когда ОКТ замерзает, он становится белым и, и вы больше не можете видеть свои ткани. Так что вы точно захотите нанести маркировку перманентным маркером. Криоформа.

На самом деле у меня появился пузырь в ОКТ, поэтому я собираюсь использовать щипцы, чтобы просто вытолкнуть его через край. Вы же не хотите, чтобы это мешало вам, замораживанию ваших тканей. Итак, теперь я собираюсь перенести голову из этой чашки в ОКТ, которая находится в моей форме.

Я просто собираюсь вытащить его из формы и очень аккуратно поместить в форму. Затем я перейду к микроскопу, где сориентирую ткань. У меня есть ткань в моей криоформе, и я собираюсь посмотреть через эндоскоп, чтобы сориентировать ее.

Я собираюсь делать корональные сечения через эту мышиную голову. Поэтому мне нужно сориентировать его так, чтобы я мог расположить его в криостате для корональных срезов. Итак, опять же, я использую эти старые притупленные щипцы, и, как вы можете видеть, здесь есть несколько пузырей, и я постараюсь изо всех сил, чтобы их вытащить.

Но эти маленькие пузыри не плохие, не плохие. Я ничего не заметил с этими маленькими пузырями. Вы просто не хотите больших пузырей.

Так что я просто собираюсь вытащить их как можно лучше и обязательно часто протирать щипцы, потому что так можно лучше избежать пузырей. И теперь, если вы видите мою маркировку, у меня есть буква t здесь вверху и буква F слева здесь. Для меня это просто указывает на то, что голова, верхняя часть головы будет вверху, а передняя часть или лицо будет слева от меня.

Таким образом, я знаю, через какую поверхность нужно разрезать для корональных срезов, и я просто подталкиваю ткань. И опять же, иногда это приводит к образованию пузырьков, и вы просто хотите вытолкнуть их, чтобы они не замерзли вместе с тканью. Так что пузыри плохи, в основном потому, что когда вы замерзаете, пузырьки тканей могут вызвать непостоянное замерзание вас.

Цель мгновенной заморозки — заморозить все сразу. Кроме того, когда вы разрезаете ткань и криостат, если лезвие проходит через пузырь, а не через ОКТ или ткань, это может вызвать зацепку или разрыв и разрушить или, знаете, разорвать вашу ткань. Так что вы точно хотите избежать как бы то ни было пузырей любой ценой.

Особенно крупные. Так что я все еще ориентируюсь здесь. Эта ткань была зафиксирована на 24 часа, поэтому она довольно устойчива к моим манипуляциям.

Другие ткани могут быть немного мягче, поэтому вам просто нужно быть очень нежными. Итак, как только я расположил его под прицелом лицом влево и макушкой вверх, мне нужно будет убедиться, что он правильный и в других плоскостях ориентации. Итак, я собираюсь поднять и посмотреть на все грани куба, чтобы убедиться, что он правильный.

И я вижу, что он немного наклонен вниз, поэтому мне приходится просто поднимать щипцами. Хорошо? А это определенно требует много практики. Ладно, выглядит неплохо.

Теперь я пройду сюда и заморозлю его в жидком азоте. Хорошо, теперь, когда ткань правильно сориентирована в криоформе, я собираюсь залить жидкий азот в эту чашку. Это просто обычная пластиковая чашка Петри для культивирования тканей до самого верха.

Он довольно быстро испаряется. Я собираюсь взять щипцы и опустить криоформу. И, как вы можете видеть, я на самом деле согнул нижнюю губу.

Это определенно обеспечивает лучшее, лучшее управление. Я собираюсь его заморозить. И по мере того, как ткань и ОКТ замерзают, она становится сплошным белым.

И как только все будет готово, все будет белым. И тогда мне нужно быстро поместить замороженную ткань в морозильную камеру минус 80 для хранения. Вы должны держать его так, чтобы ткань не погружалась в воду.

Поэтому вы должны быть очень осторожны, чтобы просто удерживать его на верхней поверхности жидкого азота. Ладно, теперь он заморожен. Подержите его там еще несколько секунд, прежде чем я перейду к минус 80.

Ладно, теперь я собираюсь довести до минус 80. Итак, я взял свою ткань из минус 80 и поместил ее в этот криостат. На самом деле температура в камере снизилась до минус 24 градусов по Цельсию.

В настоящее время вам нужно дать ткани сбалансироваться в течение примерно получаса или часа, прежде чем вы сможете начать секцию. В противном случае он будет слишком хрупким. Так что, хотя все характеристики криоса отличаются, я просто укажу на некоторые основные моменты об этой машине.

Поэтому мы используем Leica CM 30 50 s. Это хорошая машина, потому что у нее есть отдельный блок охлаждения для самого образца, что является приятным дополнительным преимуществом. Вы можете установить температуру образца, и для разных тканей требуется разная температура для резки.

Поэтому, когда вы впервые нагружаете свои ткани, вам нужно сделать несколько корректировок. И они похожи по всем характеристикам криоса. Это электроника, часть из них управляется вручную.

Например, вам нужно будет втянуть руку криостата или продвинуть ее вперед, чтобы расположить дальше или ближе к лезвию. Вы можете делать это быстро или медленно. Вы можете установить толщину вашего разреза с помощью этого плюса или минуса здесь.

И вы будете выбирать между отделкой или толщиной секции, которая указана на средней кнопке здесь. Вы можете установить температуру камеры или самого образца рядом с этим цифровым дисплеем, просто нажав его и используя стрелки вверх или вниз для регулировки температуры. Поэтому, когда мы делаем криосекцию, мы используем эти продукты марки Super Frosts марки рыбоискателя плюс предметные стекла для микроскопа.

Они покрываются небольшим количеством клея, чтобы ткань во время обработки не отрывалась. Иногда во время разрезания вы заметите, что ткань кажется немного мягкой, и некоторые признаки этого будут заключаться в том, что она ударяется о лезвие и собирается в пучки. И что вы можете использовать, чтобы исправить это, так это эта супердружелюбная заморозка марки Fisher.

Это, это вспышка, она замораживает ткань, и вы просто направляете ее на свою ткань и нажимаете на спусковой крючок, и она быстро снова замораживает ткань, если она слишком мягкая. Прежде чем установить ткань на патрон для разделки, я хотел бы провести для вас краткую экскурсию по некоторым вещам в машине. Таким образом, именно здесь вы фактически загружаете лезвие, которое закреплено этой металлической пластиной.

Потянув этот рычаг вверх, вы можете снять и заменить лезвие по мере необходимости. Убедитесь, что это красиво и безопасно. Вы не хотите чрезмерно закрепить лезвие, иначе оно действительно деформируется.

И вы заметите, что толщина ткани непостоянна, не постоянна. Так что вы хотите, вы не хотите давить на эту руку до упора. Вы просто хотите доставить его туда, где он находится, даже с помощью самого лезвия.

Вот еще одна вещь, которую вам, возможно, придется скорректировать во время секционирования. Она называется пластиной защиты от крена. Это кусок стекла, который подходит к этому держателю здесь, и вы можете отрегулировать его с помощью этого подпружиненного винта здесь.

И вы в основном перемещаете его вперед или назад. И это сохранит вашу ткань или секции плоскими, чтобы вы могли закрепить их на предметном стекле. Еще одна вещь, которую вы, возможно, захотите отрегулировать во время разделки, - это место на лезвии, которое выполняет фактическую резку.

Итак, как вы это регулируете, то есть вы просто поднимаете этот рычаг и можете сдвинуть всю эту штуковину влево или вправо. И вы используете его только в том случае, если замечаете, что ваша ткань зацепляется за определенную часть лезвия, или вы хотите сэкономить лезвия, потому что они довольно дорогие. Таким образом, вы можете найти красивую чистую область, просто двигая ее вперед и назад.

Еще одна вещь, которую вы можете отрегулировать, - это угол резки. Теперь здесь, сбоку, которую вы не сможете увидеть, есть три разных положения. Мы просто используем среднее положение, и вы регулируете его, поднимая другой рычаг.

И, и это может, вы можете заставить эту штуковину подниматься и опускаться. Мы всегда держим его посередине. Так что я просто собираюсь продолжать в том же духе.

Вот эта головка криостата. На самом деле он будет удерживать замороженный образец ткани во время его разрезания. Он раскачивается вверх и вниз и продвигается к лезвию.

И в основном вы устанавливаете ткань на этот патрон здесь, и мы помещаем патрон в головку, затягиваем ее, а затем используем эти ручки сзади, чтобы отрегулировать угол, чтобы сделать разрез более прямым. Итак, теперь я собираюсь установить салфетку на патрон. Вы хотите держать патроны при комнатной температуре, потому что сначала вы добавляете слой ОКТ, и вы не хотите, чтобы он сразу замерз, потому что вы хотите, чтобы это был красивый плоский слой.

И мы будем использовать эту штуковину здесь, она называется тепловытяжкой. На самом деле, он будет использоваться для сплющивания ОКТ, когда он замерзает. Итак, сначала я беру комнатную температуру и помещаю ее в этот держатель.

Возьмем несколько моих пузырей ОКТ. Здесь не имеет значения, потому что они будут вытеснены. Просто прибавьте, немного, не надо много.

Возьмите тепловую вытяжку и просто сядьте на нее. Подождите несколько секунд. И тогда вы можете видеть, что ОКТ красивая и плоская.

Итак, теперь у меня есть ткань, и мне нужно отметить фактическую ОКТ. Итак, я отмечу точку на ОКТ, чтобы указать ее положение. Итак, я только что отметил верхнюю часть синей точкой.

Теперь я вынимаю блок ткани из формы и делаю это, просто надавливая на его заднюю часть. Поэтому я собираюсь осторожно надавить на заднюю часть и просто вложить ее в руку, но опять же, я не хочу, чтобы она оттаяла. Поэтому я вставил его обратно.

Теперь вы можете видеть блок ткани с синей меткой, которую я на него нанес. Так что я знаю, что это верхняя часть головы эмбриона. И я хочу сделать разрез через лицо, потому что это корональные отделы.

Итак, теперь я добавлю еще одну каплю большой капли ОКТА, и мне придется действовать быстро, потому что все холодно. И я возьму свою салфетку и положу ее прямо посередине, убедившись, что она прилегает ровно к уже готовому ложу ОКТ. Теперь я просто дам ему застыть, и это займет минуту или две.

Так что теперь он закончил замерзать. И я собираюсь взять ткань, которая закреплена на патроне, поместить ее в головку, выровнять ее как можно прямее, а затем затянуть. Может, это красиво и плотно.

Я собираюсь разместить его прямо перед лезвием, а затем продвинуть его вперед, что может занять несколько секунд. Хорошо, теперь я собираюсь использовать плоский край лезвия, чтобы действительно точно расположить ткань. Так что я просто смотрю на край и раскачиваю ткань вверх и вниз, чтобы убедиться, что края совпадают.

Если бы они этого не делали, вы знаете, это могло бы выглядеть примерно так. Я, очевидно, преувеличиваю, но здесь вы можете видеть, что это не прямое направление, направленное против лезвия. Поэтому я просто продолжаю вносить коррективы, пока не почувствую, что это настолько прямо, насколько я могу это сделать.

Я думаю, что это довольно хорошо. Итак, я смотрю со всех сторон, чтобы убедиться, что ткань будет резать прямо о лезвие, и я использую край лезвия, чтобы указать на это. Итак, я смотрю вверх и смотрю сбоку, и ткань на самом деле выглядит довольно хорошо.

Мне не нужно делать много настроек, но если бы я это сделал, я бы просто использовал ручки, которые находятся на затылке. Поворачивая их влево или вправо, вы можете увидеть, что таким образом можно выполнять тонкие настройки. Но выглядит довольно неплохо.

Теперь я, на самом деле, продвигаю ткань. Это так, он еще не режет, потому что он не против лезвия. Ткань встраивается внутрь глубоко в ОКТ.

Таким образом, доступ к ткани может занять несколько минут. Вы не хотите двигаться слишком быстро, потому что это может зацепить и сломать ОКТ и вашу ткань, но вы также не хотите двигаться слишком медленно, потому что это может занять целую вечность. На этой машине есть одна приятная функция, с помощью которой вы можете выполнить обрезку на более толстом участке, что позволит вам двигаться быстрее.

Так что сейчас я на самом деле, я прохожу через ОКТ, поэтому я немного замедляюсь. Так что я все еще не добрался до ткани, но это время, когда я оцениваю, как будет проходить секция. Многие переменные могут привести к тому, что ваше рассечение тканей будет проходить как хорошо, так и очень плохо.

Я обнаружил, что чаще всего с этим криостатом ткань на самом деле слишком холодная. Я, я снизил температуру, но все равно кажется, что слишком холодно. И что происходит, так это то, что лезвие будет вибрировать через ткань или через ОКТ.

Итак, вы получите эти маленькие линии, эти горизонтальные линии через ОКТ. Что я делаю, так это беру большой палец и просто нагреваю край, нагреваю ОКТ, просто слегка касаясь его, скользя большим пальцем, не очень долго. А потом, когда я просмотрел его, я заметил, что они получаются намного лучше, и болтовня прекратилась.

Так что это те вещи, которые я буду оценивать, я буду оценивать, прежде чем дойду до тканей. Итак, я заметил, что когда лезвие проходит через ткань, в ОКТ появляется загвоздка или трещина. Поэтому одна из вещей, которую я делаю в первую очередь, это меняю лезвие.

Я не уверен, как долго это лезвие было здесь и кто его использовал до меня, поэтому я просто пойду дальше и достану новое лезвие. Очевидно, что они очень острые, поэтому нужно быть осторожным. Итак, я собираюсь отрегулировать пластину для предотвращения кренов, и здесь внизу есть винтовой подпружиненный винт, под который вам просто нужно дотянуться, и вы можете переместить его внутрь или наружу.

Итак, я продвинулся и разрезал достаточно, чтобы теперь я вошел в ткань. И, к сожалению, есть трещина в блоке ОКТ, которая случается часто, и, к сожалению, вы не можете ее контролировать, но есть вещи, которые вы можете сделать, чтобы исправить это. Если трещина прошла сквозь ткань, то вам придется выбросить образец или попытаться спасти то, что вы можете.

В этом случае трещина как бы находится над тканью. Итак, что я собираюсь сделать, так это взять лезвие бритвы, которое было в криостате. Он охлажденный.

И я попробую просто обрезать треснувшую часть, которая находится в верхней части блока ОКТ. Итак, я снова буду использовать большой палец, чтобы нагреть поверхность ОКТ-блока. А затем я пройдусь по разделу, и если вы можете увидеть его здесь, он треснул.

Итак, я снял кусок с тканью, а затем оставшуюся часть окт-ОКТ, которую я только что сбросил, это была треснувшая часть. Итак, что я собираюсь сделать, так это попытаться обрезать эту треснувшую часть с помощью охлажденного лезвия бритвы. Мне нужно идти очень прямо, и мне приходится использовать обе руки и равномерно надавливать на лезвие.

И я собираюсь покачивать лезвием взад и вперед в ОКТ. Итак, я раскачиваюсь взад и вперед, медленно разрезая ОКТ. Надеюсь, я удаляю треснувшую часть.

Ладно, я собираюсь урезать, удалив этот избыток ОКТ. Хорошо, выглядит неплохо. Затем я собираюсь немного втянуть головку, потому что я создал края, которые могут зацепиться за лезвие, и если это произойдет, это может фактически сломать ОКТ и ткань, что испортит мой образец.

Итак, я втянулся, так что мне нужно будет еще немного продвинуться, чтобы вернуться в ткань, и, надеюсь, я исправил трещину. Хорошо, теперь я возвращаюсь к ткани. Ладно, похоже, я, я все же исправил.

Так что в ОКТ больше нет никаких трещин, которые значительно упростили бы захват участков. Итак, теперь я перейду к той части ткани, которая меня интересует. Прямо сейчас я, я только сейчас выхожу на поверхность, и я хотел бы проникнуть в мозг этого эмбриона.

Они достаточно большие, чтобы я мог видеть те структуры, которые меня интересуют. Я забыл упомянуть, что я использую эти щетки для очистки лезвия между каждой секцией, которую я собираюсь снимать. Этот большой предназначен только для очистки области и удаления излишков ОКТ.

Я также использую эти более тонкие кисти для манипуляций с секцией относительно этой холодной пластины здесь, чтобы расположить ее, когда я снимаю ее на секцию. Опять же, они хранятся в холоде, поэтому ОКТ не плавится и не прилипает к щеткам. Итак, чтобы захватить ткань, я сначала нагрею ОКТ и ткань большим пальцем.

И я возьму один из этих слайдов, которые я уже подписала. Я держу его вверх ногами и каждый делает это по-своему. Но я делаю это так: мне нравится держать правой рукой верхний правый угол, когда слайд направлен вниз.

А затем использую большой палец левой руки в качестве точки опоры, чтобы я мог спуститься прямо к пластине и захватить секцию. ОКТ и ткань фактически расплавятся на предметном стекле и крепятся сами. Итак, сначала я согреваю ткань большим пальцем, медленно разрезаю, берусь за предметное стекло, держу правый угол правой рукой, перемещаю тарелку, опускаю ее прямо вниз, даю ей растаять.

Я посмотрю на ткань, чтобы убедиться, что на ней нет складок или пузырей, и она выглядит хорошо. И я буду продолжать это делать, пока не разрежу весь мозг. Сейчас я смотрю на срезы через область препарирования, чтобы убедиться, что они, что они выглядят хорошо, и вы можете видеть, что передний мозг находится в верхней части раздела, и все они выглядят очень красиво.

Вы можете использовать эти криосекции для таких вещей, как гибридизация in situ. Иногда мы делаем базовую гистологию, окрашивание h и e. Вы также можете провести иммунофлюоресценцию, и вы знаете, ряд подобных анализов.

В частности, для меня эти участки были зафиксированы и обработаны для гибридизации in situ. Так что это то, что я буду делать дальше.