Фотопревращения Очищенная флуоресцентных белков и двойного зонда Оптические Выделение в живых клетках

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании флуоресцентных белков M orange и Two Andron для двухзонного оптического выделения с целью селективного маркирования четырех отдельных популяций клеток или клеточных компартментов. Это достигается путем первоначального освещения клеток низкоинтенсивным возбуждающим светом с длиной волны 488 нанометров для отключения всей зеленой флуоресценции. На втором этапе клетки подвергаются воздействию высокоинтенсивного возбуждающего света с длиной волны 488 нанометров, что вызывает фотоконверсию флуоресценции m orange в красную.

Затем клетки подвергаются двухфотонному возбуждению с длиной волны 800 нанометров для активации двойной флуоресценции. Вновь полученные результаты показывают, что возможна маркировка клеток в четырех различных комбинациях на основе оптического выделения с использованием двойного зонда M Orange two и drawn ppa. Основным преимуществом данной процедуры перед существующими методами, такими как субклеточное фракционирование, является то, что она проводится на живых клетках.

Данная процедура может помочь ответить на ключевые вопросы биологии бета-клеток, например, почему секретируется лишь небольшая часть инсулиновых везикул. Хотя эта процедура позволяет глубже понять функционирование бета-клеток, она может быть применена и к другим системам, например, для отслеживания раковых клеток in vivo. Образец капель с флуоресцентным белком представляет собой октальную водную эмульсию, в водной фазе которой находится флуоресцентный белок.

Для проведения микроскопии данную эмульсию помещают между предметным стеклом и квадратным покровным стеклом размером 22 мм. Перед началом процедуры предметные и покровные стекла необходимо очистить и покрыть гидрофобным агентом. Очистите стеклянные изделия, промывая их ацетоном в течение пяти минут.

После промывки оставьте стеклянную посуду до полного высыхания на воздухе. Затем приготовьте 2% раствор метилтриметоксисилана в ацетоне и погрузите стеклянную посуду в раствор на две минуты. После нанесения покрытия извлеките стеклянную посуду из раствора и дайте ей высохнуть.

Затем промойте стеклянную посуду 70% ethanol из распылителя. После промывки снова дайте посуде высохнуть на воздухе и удалите остатки жидкости. При использовании сжатого воздуха покрытая стеклянная посуда может храниться не менее одного месяца.

После подготовки стеклянной посуды возьмите флуоресцентные белки, предварительно очищенные из e coli в качестве белков с His-тегом. Измерьте спектр поглощения очищенного белка. Приготовьте стоковый раствор с оптической плотностью приблизительно 0.1 в Трис-солевом буферном растворе с pH 8, содержащем 0.1% бычьего сывороточного альбумина.

Дополнительно приготовьте 10 миллилитров смеси октана и трис-буферизованного солевого раствора в соотношении один к одному в конической пробирке объемом 15 миллилитров и тщательно перемешайте. После перемешивания оставьте смесь до полного разделения фаз. Верхняя фаза представляет собой октан для создания эмульсии; с помощью пипетки перенесите 45 µL октана и 5 µL флуоресцентного белка в пробирку типа эппендорф.

Несколько раз постучите по пробирке, чтобы начать формирование эмульсии, затем подвергните пробирку воздействию ультразвука в течение 30 секунд в ультразвуковой бане. Тем временем подготовьте покрывное стекло и предметное стекло с покрытием после обработки ультразвуком. Эмульсия должна стать полностью мутной.

Немедленно перенесите пипеткой 4 µL эмульсии из центра пробирки на покрытое предметное стекло и накройте его покрывальным стеклом. Эмульсия должна равномерно распределиться между предметным и покрывальным стеклами. В течение нескольких минут образец должен стабилизироваться.

Следующая процедура представляет собой общую стратегию организации эксперимента по фотоконверсии флуоресцентных белков на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Данную процедуру можно применять как для очищенных белков, так и для живых клеток. В этом эксперименте в качестве общего отправного пункта для проведения фотоконверсии используется образец в виде капли, содержащий очищенный белок m orange two.

Настройте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп следующим образом. Используйте масляный иммерсионный объектив с увеличением 40 x и числовой апертурой 1.3, установите размер изображения 512 на 512 пикселей. Установите время экспозиции пикселя (dwell time) на шесть микросекунд на сканирование, масштаб (zoom) — на четыре и увеличьте размер диафрагмы (pinhole), чтобы обеспечить разрешение по оси Z в три микрона.

Настройте два канала детектирования для исходной и фотоконвертированной флуоресценции, а также канал фотоконверсии. Наблюдайте за оранжевым видом, используя возбуждающий свет с длиной волны 561 нм, и регистрируйте флуоресценцию в диапазоне от 570 до 630 нм. Детектируйте фотоконвертированный красный вид, используя возбуждающий свет с длиной волны 633 нм, и регистрируйте флуоресценцию в диапазоне от 640 до 700 нм.

Для канала фотоконверсии выберите линию лазера 488 нанометров и регистрируйте флуоресценцию в диапазоне от 490 до 540 нанометров. Визуализация. Канал фотоконверсии не является строго обязательным, но может быть полезен. Чтобы начать эксперимент, используйте канал детектора для получения изображений начальной флуоресценции при непрерывном сканировании, чтобы настроить мощность лазера и усиление детектора для оптимального качества изображения.

Затем активируйте канал фотоконверсии и выберите низкую мощность лазера. Начните съемку серии таймлапс-изображений и постепенно увеличивайте мощность лазера фотоконверсии до тех пор, пока не будет наблюдаться значительное выцветание исходной флуоресценции. Продолжайте сканирование до тех пор, пока исходная флуоресценция не выцветет примерно на 75%.

Затем деактивируйте канал фотоконверсии и активируйте канал детекции фотоконвертированной флуоресценции. Начните получение изображений при высоком усилении детектора и низкой мощности лазера. Затем постепенно увеличивайте мощность лазера до момента обнаружения фотоконвертированной флуоресценции.

После обнаружения объекта отрегулируйте мощность лазера и усиление детектора для достижения оптимального качества изображения. Наконец, оптимизируйте мощность и длительность лазерного излучения, используемого для фотоконверсии. Увеличение мощности лазера ускорит скорость фотоконверсии.

Однако слишком высокая мощность лазера приведет к фотообесцвечиванию белка. После определения оптимальной степени фотоконверсии, мощности и длительности лазерного излучения эти параметры можно использовать для настройки стандартного модуля фотообесцвечивания или модуля восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. В этом случае канал фотоконверсии больше не потребуется благодаря спектральным свойствам красного смещения M orange two.

Этот белок может быть использован в сочетании с зеленым фотопереключаемым флуоресцентным белком drawn PU для двухзонного оптического маркирования. Чтобы начать двухзонное оптическое маркирование, вырастите клетки HeLa в чашках с стеклянным дном (mat tech). За 24 часа до визуализации проведите трансфекцию клеток плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, используя стандартный протокол трансфекции с помощью LIPOFECTAMINE 2000.

Поместите живые клетки под конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и настройте его для фотоконверсии M orange two, как было описано ранее. Затем настройте микроскоп для фотопереключения DPA. DPA возбуждается светом с длиной волны 488 нанометров, и его флуоресценция может быть визуализирована с использованием канала фотоконверсии M orange two.

Необходимо минимизировать мощность лазера при визуализации MPA, так как избыточная мощность приведет к инактивации mpa. Добавьте канал для фотоактивации MPA, используя двухфотонное возбуждение при 800 нм; затем определите мощность лазера, необходимую для визуализации фотоактивации и фотоинактивации флуоресценции OFA.

Одним из наиболее сложных аспектов данной процедуры является инактивация RPA без фотопреобразования M orange, поскольку оба этих процесса происходят при одной и той же длине волны. Чтобы предотвратить это, крайне важно тщательно оптимизировать процесс фотопреобразования.

Мощность и длительность лазерного излучения. Соблюдайте осторожность, так как при возбуждении светом с длиной волны 488 нанометров происходит как фотоконверсия M orange two, так и инактивация PU. Для инактивации PU без значительной фотоконверсии M orange two используйте более низкую мощность лазера после того, как будут установлены параметры для фотоконверсии M orange two и фотопереключения DPA.

Можно реализовать метод оптического выделения с использованием двух зондов. Сначала инактивируйте флуоресценцию DPA во всем поле зрения, используя возбуждение длиной волны 488 нанометров при низкой мощности. Затем выберите интересующую область и переведите m orange two в активное состояние, используя возбуждение длиной волны 488 нанометров при высокой мощности.

Наконец, выберите область интереса и активируйте флуоресценцию DPA с помощью двухфотонного возбуждения на длине волны 800 нанометров. Образцы капель с флуоресцентным белком идеально подходят для настройки приложений фотоконверсии на конфокальном микроскопе. При правильной подготовке образца капли выглядят очень однородными.

Однако при подготовке образца без использования покровного стекла капли имеют тенденцию сплющиваться о одну из стеклянных поверхностей. В отсутствие 0.1%BSA флуоресцентный белок стремится накапливаться на одной из границ раздела фаз вода-октанол. Создание гало флуоресцентного фотопревращения критически зависит от мощности лазера и продолжительности экспозиции.

Слишком высокая мощность лазера или слишком длительная экспозиция вызывают фотовыцветание, что приводит к снижению интенсивности фотоконвертированной красной флуоресценции. Различные спектральные свойства M orange two и PHO позволяют проводить двойное оптическое выделение зондов перед фотоконверсией; клетки, экспрессирующие M orange two, гистон H2B и DPA mito, демонстрируют оранжевую флуоресценцию в ядре и зеленую флуоресценцию в митохондриях. При выключении всей флуоресценции с помощью возбуждения длиной волны 488 нм при низкой мощности фотоконверсия M orange минимальна.

M orange two может быть подвергнут фотоконверсии в красный цвет при высокомощном возбуждении с длиной волны 488 нанометров. После фотоконверсии M orange two флуоресценция drawn puff может быть снова активирована с помощью двухфотонного возбуждения с длиной волны 800 нанометров. Использование двухзондового оптического выделения позволяет маркировать клетки четырьмя разными способами.

С помощью данного метода можно специфически пометить четыре разные популяции клеток. Как было показано, одним из наиболее сложных аспектов этой процедуры является инактивация MPA без фотоконверсии m orange. После освоения этого метода можно проводить дальнейшие эксперименты с использованием данной системы, например, отслеживание нескольких популяций бета-клеток поджелудочной железы.

На этом всё. Надеюсь, эта презентация была вам полезна. Желаю удачи в проведении ваших экспериментов.