Методы для работы с изображениями Ca ^{2 +} Сигнализация в человеческой спермы

Общая цель данной процедуры — получение серий изображений иммобилизованных сперматозоидов человека, меченных флуоресцентным красителем-индикатором кальция. Подвижные клетки изолируют из семальной плазмы путем их перемещения в инкубационную среду. После капацитации клетки метят флуоресцентным индикатором кальция, затем переносят в камеру для визуализации, которая установлена на инвертированном флуоресцентном микроскопе.

Ответы концентрации ионов кальция регистрируются в виде серии изображений с временным интервалом (time-lapse) и анализируются для извлечения ответов отдельных клеток. Здравствуйте, я Эдвин Андрес Моралес Гарсия из лаборатории доктора Стивена Дж. Паблик Ковы факультета биомедицинских наук Бирмингемского университета, Великобритания. Я Кэтрин Нэш, также из лаборатории Паблик Оверлап.

Меня зовут Дженнифер Моррис, я представляю Public Overlap. Сегодня мы продемонстрируем процедуру визуализации внутриклеточных кальциевых ответов в отдельных человеческих сперматозоидах. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения регуляции функций сперматозоидов с помощью стимулов, полученных из яйцеклетки и женского репродуктивного тракта.

Приступим к работе. Храните образцы семени при температуре 37 °C не более 30 минут с момента сбора. Чтобы выделить подвижные клетки из семенной плазмы, внесите 1 мл сбалансированного солевого раствора L'S с добавлением 0,3% BSA (сокращенно S-E-B-S-S) в серию полистирольных пробирок с круглым дном объемом 5 мл. Осторожно нанесите 0,3 мл семени поверх слоя S-E-B-S-S в каждой пробирке и неплотно закройте их крышками.

Инкубируйте пробирки под углом 45 градусов в течение одного часа при 37 °C и 6% carbon dioxide. Чтобы подвижные клетки могли мигрировать вверх в S-E-B-S-S, осторожно отберите пипеткой верхние 0,7 mL раствора и перенесите содержимое всех пробирок в чистую полистирольную центрифужную пробирку объемом 15 mL. Осторожно встряхните для перемешивания; подсчитайте количество клеток, иммобилизованных формалином, в новой камере Горяева.

Доведите концентрацию до 6 миллионов клеток на миллилитр в S-E-B-S-S и разделите сперматозоиды на аликвоты по 200 µL в полистирольные пробирки с круглым дном объемом пять миллилитров. Слегка прикройте крышками. Если изучается реакция капацитированных клеток, инкубируйте пробирки от пяти до шести часов при 37 °C и 6% CO2 для обеспечения капацитации. Нанесите 10 µL 10% полилизина в виде нескольких мелких капель в центр предметного стекла размером 22 на 50 миллиметров.

Возьмите покровное стекло номер один и дайте ему полностью высохнуть. Используйте вакуумную смазку, чтобы прикрепить покровное стекло обработанной стороной вверх к подходящей визуализационной камере.

Для каждого эксперимента по визуализации выберите одну пробирку с капацитированными клетками и добавьте 1,2 µL Calcium dependent organ green в концентрации 2,5 mg/mL, растворенного в DMSO, чтобы конечная концентрация составила 10 µM. Инкубируйте пробирку в течение 40 минут при 37 °C и 6% CO2.

С помощью дозатора Pepto на 200 мкл с наконечником P 200 полностью удалите весь раствор из пробирки. Заполните камеру, осторожно вводя раствор через входной порт. Наклоните камеру так, чтобы пузырьки воздуха вышли через выходной порт.

Поместите всю камеру в инкубатор и инкубируйте еще 20 минут при 37 °C и 6% углекислого газа (CO₂), чтобы сперматозоиды успели прикрепиться к поли-D-лизину. Установите камеру на перевернутый флуоресцентный микроскоп и подключите ее к аппарату для перфузии.

Оставьте препарат в темноте минимум на 10 минут, чтобы перфузия вымыла свободные клетки и внеклеточный матрикс. При рассмотрении в фазово-контрастном микроскопе с увеличением 40x или 60x выберите поле зрения, в котором расстояние между клетками достаточно для раздельной оценки флуоресценции каждой клетки. Клетки должны быть надежно прикреплены, но желательно, чтобы они проявляли выраженную активность формирования жгутиков.

Переключите микроскоп на канал зеленой флуоресценции. Установите время экспозиции на минимальный уровень, необходимый для получения четкого флуоресцентного изображения, чтобы уменьшить фотовыгорание в программном обеспечении IQ.

Активируйте режим серийного получения изображений во времени. Выполняйте захват кадров с частотой 0,1 Гц, используя управляемый программно затвор для ограничения освещения. После первоначальной записи в течение контрольного периода от трех до пяти минут измените концентрацию кальция в физиологическом растворе или введите препараты, заменив раствор в резервуаре системы перфузии.

Отметьте время добавления каждого стимула в заголовке и рассчитайте время его поступления в камеру, как описано в текстовой части данного протокола. Для офлайн-анализа изображений используйте один из инструментов рисования, чтобы выделить область интереса или ROI вокруг каждой клетки или ее части; в данном случае — заднюю часть головки сперматозоида, поскольку накопленный кальций мобилизуется в этой области. Используйте ползунок для просмотра серии изображений.

Выявите и удалите клетки, которые вышли за пределы ROI, перекрываются с другими клетками или продемонстрировали резкое и быстрое увеличение интенсивности флуоресценции с последующим резким спадом, что характерно для гибели клеток. Используйте функцию анализа для построения временного ряда интенсивности флуоресценции для каждого ROI. Затем данные можно экспортировать и проанализировать в электронной таблице.

Эти изображения представляют собой серию, полученную при стимуляции тремя микромолярными прогестероном. Нижний ряд представлен в псевдоцветах. Для лучшей иллюстрации относительных изменений интенсивности прогестерон был введен в камеру здесь.

Эти результаты представлены в виде ускоренного видео. Обратите внимание на резкий скачок интенсивности флуоресценции с последующим медленным ростом, что указывает на соответствующие изменения уровней внутриклеточного кальция. Данные здесь количественно определены на основе средних значений интенсивности в задней части головки трех клеток.

Три микромолярных прогестерона было добавлено в момент, отмеченный стрелкой. Пунктирная линия показывает среднюю флуоресценцию контрольной группы. Сегодня мы продемонстрировали вам, как изолировать клетки высокого качества, ввести в них кальций-чувствительный краситель и отслеживать ответ отдельных клеток на стимуляцию.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать максимально качественную популяцию клеток, а также минимизировать освещение клеток во избежание фотоповреждения и выбрать краситель, который лучше всего подходит для изучения интересующих вас ответов. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.