Генерация сфероидов из клеточных линий: трехмерный (3D) метод культивирования клеток

Вырастите нужную клеточную линию в качестве адгезивного 2D монослоя. Удалите питательную среду и промойте фосфатно-солевым буфером или PBS. Затем добавьте трипсин и инкубируйте, пока клетки отделяются от поверхности колбы и приобретают круглую форму. Добавьте свежую среду для нейтрализации трипсина и подвески клеток. Переложите смесь в коническую трубку и используйте центрифугу для гранулирования ячеек.

Замените надосадочную жидкость свежей средой и повторно суспендируйте гранулу клетки. С помощью гемоцитометра подсчитывают количество клеток и рассчитывают рабочую концентрацию. Затем перелейте нужное количество клеточной смеси в лунку со сверхнизкой адгезией с круглым дном и инкубируйте. Ячейки оседают на дно и агрегируются. В конечном итоге они прикрепятся друг к другу и сформируют компактную сборку 3D-клеток, сфероид.

В примере протокола мы увидим, как создать 3D-сфероиды из клеточной линии рака толстой кишки и как применяется визуализация в реальном времени для отслеживания их формирования. Начните с промывания интересующей линии клеток колоректального рака пятью миллилитрами PBS и удалите клетки со дна колбы 0,5 миллилитрами трипсина в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После подтверждения отслойки под микроскопом нейтрализуют фермент диссоциации клеток 10 миллилитрами готовой среды, а клетки соберут центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей полной среды для подсчета и повторно суспендируйте клетки в соотношении 1,5 умно-10 на треть клеток на миллилитр

Затем засейте по 20 микролитров клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном и поместите планшет в автоматизированный аппарат визуализации внутри инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия с 5% CO2 и влажностью 95%. Войдите в программное обеспечение для сбора данных устройства и выберите Schedule to Acquisition, Launch Add Vessel, Scan on Schedule и Create Vessel, New. Затем выберите «Тип сканирования», «Сфероид» и выберите соответствующие интересующие вас каналы «Светлое поле» и «Флуоресценция». Установите увеличение в 10 раз и выберите модель пластины и ее положение в ящике аппарата визуализации. Выберите положение лунок для визуализации и введите описание эксперимента, включая название, тип ячеек и количество ячеек.

Для настройки анализа выберите «Отложить анализ на потом», щелкните правой кнопкой мыши временную шкалу и выберите «Установить интервал выбранной группы сканирования», а также установите для параметра «Добавлять сканирования каждые время» значение «четыре часа» и «Всего на 24 часа». Затем установите время начала по крайней мере через один час после инкубации в автоматизированном аппарате визуализации. Чтобы проверить ход роста сфероида, каждые два дня входите в программное обеспечение для визуализации и выберите «Просмотреть последние сканирования». Дважды щелкните по интересующему вас эксперименту и выберите «Светлое поле» на панели «Каналы изображения». Затем используйте инструмент Измерить объекты изображения, чтобы измерить диаметр сфероидов. Добавление 50 микролитров полной среды в лунку на четвертый день, чтобы ограничить любые эффекты появления среды.