ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Гибридизация процедуры Один гибридизации трубка будет принимать по 1 или 2 мембраны (размер 22 на 22 см). Используйте 50 мл гибридизации смеси и 0,5 мг ДНК-зонда (10 нг / мл, конечная концентрация) в гибридизации трубки. Для достижения наилучших результатов, используйте гель-очищенной ДНК в качестве зонда. Если расширение масштабов подготовки зонда, увеличение количества трубок, а не увеличения количества реагентов в трубке. Зонд подготовки (0,5 мг ДНК): <ol><li> Развести 15 мкл поперечных связей решение с 60 мкл воды. </li><li> Развести ДНК до 10 нг / мкл водой до 50 мкл общего объема в винт крышками микропробирок. </li><li> Денатурации ДНК в течение 5 минут в кипящую воду. </li><li> Быстро передавайте в лед и дайте остыть в течение 5 мин. Спиновые кратко. </li><li> Добавить 50 мкл реакционного буфера и аккуратно перемешать. </li><li> Добавьте 10 мкл реагента маркировки и аккуратно перемешать. </li><li> Добавить 50 мкл разбавленного поперечных связей решение с шага 1 и аккуратно перемешать. Vortex мягко и спина кратко. </li><li> Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. </li><li> Держите на льду в течение до 2 ч или добавить равный объем 100% глицерина и хранить при температуре -20 ° C. Примечание: Использование воды, поставляемой в комплекте. Храните все реагенты на льду, если не указано иное. </li></ol> Мембранные подготовки и гибридизации <ol><li> Разогрейте 50 мл буфера гибридизации и гибридизации трубки до 60 ° C. </li><li> Добавить гибридизации буфера для гибридизации трубки. Свернуть мембраны (ов) и добавить к гибридизации трубки. (Если добавить 2 мембраны в трубку, сначала свернуть одной мембраны полностью, затем сверните другие мембраны на первое место в том же направлении.) </li><li> Инкубируйте гибридизации трубке при 60 ° С не менее ½ ч. (Удостоверьтесь, что мембрана (ы) промокнуть основательно.) </li><li> Передача около 1 мл буфера гибридизации с длинной пипеткой от гибридизации трубки в пробирку меченым зондом. Vortex мягко и спина кратко. Передача смесь обратно в гибридизации трубки. </li><li> Инкубировать при 60 ° С в течение ночи. Примечание: Используйте пинцет и перчатки при работе с оболочкой. Смешайте содержание гибридизации трубы аккуратно, потому что слишком много агитация вызовет постоянного образования нежелательных пены. Мембраны должны быть добавлены в мокром состоянии, замочить в буфер гибридизации или воды в случае необходимости и стечь лишней жидкости перед добавлением. </li></ol> 2. Определение процедуры Стиральная мембран <ol><li> Разогреть первичного буфера стиральную до 60 ° C. (Используйте микроволновую печь и / или нагревательного элемента.) </li><li> Если Есть две мембраны в одном гибридизации трубки, передача одной мембраны на чистую, разогретую, пустые трубки гибридизации. </li><li> Кратко промыть гибридизации трубки около 50 мл первичной промывочным буфером. </li><li> Добавить 100 мл первичной промывочный буфер в трубку гибридизации и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 10 мин. </li><li> Повторите шаг 3 и 4. </li><li> Передача мембраны для мытья тары и инкубировать, по крайней мере 250 мл вторичный буфер стирка при комнатной температуре в течение 5 мин. </li><li> Повторите шаг 6. Примечание: Мембраны могут быть оставлены на вторичном буфере стирка при комнатной температуре в течение до ½ часа до генерации сигнала. </li></ol> Поколения и обнаружения сигнала (процедура для одной мембраны) <ol><li> Лента двух кусков плоских SaranWrap на настольные (по одному на шаге 2 и по одному на шаге 4). </li><li> Тщательно отвода избыточного буфер из мембраны, касаясь углов мембраны к стенке контейнера и передачи мембраны на SaranWrap (образец вверх). </li><li> Залить 6-7 мл ECF реагента над мембраной и раз Саран запахом мембраны. Тщательно распространять ECF реагента над мембраны, мягко движущихся Kimwipe более SaranWrap. Инкубировать в течение 5 мин. </li><li> Слить избыток реагента ECF от мембраны и передача его на новый SaranWrap, сложите запахом мембраны и уплотнения краев ленты. Обложка мембрана с алюминиевой фольгой. Инкубируйте в течение 1-2 часов. </li><li> Подготовка пластин стекла сканера, распределяя 1-2 мл ECF реагента над стеклянной пластиной. Затем перенесите мембраны на стеклянную пластину (образец стороной вниз) и распространять еще 1-2 мл реагента ECF над мембраной. Наложение с SaranWrap и осторожно подтолкнуть все пузырьки воздуха в сторону от мембраны. (Вы можете разместить жесткой пластины сверху SaranWrap держать мембрана прижимается к стеклянной пластинке.) </li><li> Используйте Fuji FLA-5100 флуоресценции сканер (&quot;1 лазер 1 изображение&quot; режим) со следующими параметрами: возбуждение 473 нм, обнаружение фильтр LPB (510 нм), разрешение 50 мкм, 16-битный сигнал окончания CH1 400 В. (сканирование занимает около 15-20 мин на оболочку размером 22 на 22 см). Дополнительно: </li><li> Дайте настояться в течение 2-4 часов (или дольше). </li><li> Повторите сканирование как в шаге 6. </li></ol> 3. Зачистка и хранения процедуры (Нуф версия) <ol><li> Передача мембраны до 100% и др.hanol и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин при легком помешивании. </li><li> Замените свежие 100% этилового спирта и выдержать в течение ночи при комнатной температуре. (Мембрана может оставаться в этаноле в течение нескольких дней.) </li><li> Замените этанола с дистиллированной водой и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. </li><li> Добавить 100 мл воды и 5 мл 10% SDS (последние 0,5% SDS) для гибридизации трубки и аккуратно перемешать. Добавить мембраны. </li><li> Инкубировать при 80 ° С в течение 1 ч. </li><li> Передача мембраны чистый, пустой контейнер. </li><li> Добавить 500 мл воды и 5 мл 10% SDS (окончательный 0,1% SDS) стакан и тепло энергичный варить в микроволновой печи. </li><li> Налейте кипящую почти 0,1% SDS решением над мембраной и мягко агитировать за несколько минут. Дать остыть до комнатной температуры. </li><li> Полоскание в по меньшей мере 250 мл стерильного 100 мМ Трис рН 8, по крайней мере 10 мин. </li><li> Оберните мембраны в SaranWrap и тщательно близко краям ленты. Хранить при температуре 4 ° С. (Мембраны никогда не должна высыхать.) </li></ol>

Зачистки процедура не была оптимизирована. Тем не менее, зачистки процедурой, приведенной в инструкции производителя (2 моет каждый, 10 мин в 100% этанол, 1 мыть 1 ч при 60 ° С в 0,5% SDS) является недостаточной. По крайней мере инкубации в течение ночи в 100% этанола необходимо растворить продукт ECF реакции; несколько дней инкубации в 100% этилового спирта, похоже, не оказывают негативного влияния на способность reprobe мембраны. SDS лечения производителя также, кажется, недостаточно. Нуф пытался 1 ч при 80 ° C с 0,5% SDS следуют одна леч...

Комбинация пакет RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Метагеномных архива библиотеки крупных фрагментов смежных геномных последовательностей из микроорганизмов, не требуя предварительного культивирования. Создание упрощенной процедуре для создания и проверки метагеномных библиотек поэтому полезен для эффективного высокопроизводительного расследования генетических и метаболических свойств некультурных комплексов микроорганизмов. Здесь основные протоколы представлены на видео, которое мы предлагаем, является наиболее полезным форматом для точного описания длительный процесс, который попеременно зависит от роботов приборов и (человеческого) вмешательства руководства. Во-первых, мы использовали робототехники обнаружить библиотеку клонов на высокой плотности мембран macroarray, каждый из которых может содержать повторяющиеся колоний от двадцати четырех 384-луночных библиотеки. Автоматизация имеет важное значение для этой процедуры не только точность и скорость, но и за счет миниатюризации масштабах, необходимых, чтобы соответствовать большое количество клонов в библиотеке высокой плотности пространственных механизмов. После генерируется, мы в следующий раз продемонстрировал, как macroarray мембраны могут пройти обследование на гены интереса с использованием модифицированной версии стандартных протоколов для зонда маркировки, мембранные гибридизация и обнаружения сигнала. Мы дополняли наглядной демонстрации этих процедур с подробного письменного описания этапов и материалов, необходимых, все из которых доступны в Интернете вместе с видео.

Метагеномные библиотеки позволяют архивировать крупные фрагменты непрерывных геномных последовательностей микроорганизмов без необходимости их предварительного культивирования. Создание...

Наша цель в данном случае — инокулировать колонии из некоторых из этих метагеномных библиотек на мембранные фильтры; каждый такой фильтр может вместить 10 000 колоний. Сейчас мы укладываем этот нейлоновый фильтр на блок и разглаживаем его. Он слегка увлажнен жидкостью — в данном случае это питательная среда, бульон Луриа.Затем он перенесет эту увлажненную мембрану в робот, который автоматически инокулирует мембрану 10 000 колоний. Роботизация имеет принципиальное значение для подобных процедур, поскольку ни один человек не обладает достаточным терпением или точностью, чтобы нанести 10 000 колоний на одну такую мембрану. Именно роботы способствовали развитию геномики, позволив с высокой точностью выполнять крайне повторяющиеся операции в очень малом пространственном масштабе.В данный момент выполняется настройка робота для работы с этими тремя 84-луночными планшетами; в каждой лунке этих трех 84-луночных планшетов находится отдельная колония из метагеномной библиотеки. Сейчас робот стерилизует инокуляционные иглы, которые будут использоваться для нанесения образцов на мембрану. Иглы проходят через несколько различных растворов, один из которых — 70% ethanol для стерилизации, после чего эти инокуляционные иглы будут погружаться в 84-луночный планшет со всеми колониями.Теперь проводится стерилизация и просушка светом. После высушивания инокуляционных игл робот подаст чашку. Каждая из этих колоний фактически подвергается блоттингу и дублированию, что служит контролем.Таким образом, мы ищем две идентичные колонии, которые дадут сигнал в результате гибридизации. После того как все эти колонии были перенесены на фильтр, его снова приложили к агаризованной пластинке, которую вы видите здесь, а затем оставили при 37 °C на ночь.В результате колонии разрастаются, и в данном массиве вы видите 10 000 колоний на фильтре. Разумеется, в каждой из этих колоний содержится множество копий рекомбинантной ДНК, в данном случае — метагеномной ДНК, которую мы получили из центральной части северной части Тихого океана.Далее Салтрэм перенесет мембрану в серию растворов. Первым раствором, в который он ее переносит, является щелочной раствор гидроксида натрия, который вызовет лизис колоний. Он фактически растворяет клеточную стенку и высвобождает ДНК, чтобы она могла вступить в контакт с фильтром.Таким образом, происходит следующее: клеточные стенки всех бактерий в этих колониях растворяются, и ДНК высвобождается. После пяти минут воздействия гидроксида натрия фильтры переносят. Это место предназначено для временного размещения, так как следующим этапом будет обработка кипящим паром.Это вторая часть этапа лизиса. Сначала клетки обрабатывали сильнощелочным раствором гидроксида натрия и моющим средством додецилсульфатом натрия. Теперь эти колонии подвергаются воздействию высокой температуры — воздействию пара при 100 °C.Сочетание данного щелочного раствора, детергента и нагрева приведет к полному лизису клеток, в результате чего ДНК останется на фильтре. Через пять минут в паровой бане фильтр будет перенесен в нейтрализующий раствор. Нейтрализующий раствор фактически нейтрализует всю щелочь, после чего фильтр будет высушен.Теперь перед нами нейтрализующий раствор; образец выдерживают в нем еще в течение пяти минут. Затем фильтр переносят на фильтровальную бумагу и оставляют до полного высыхания, обычно на ночь. После того как мембраны с лизированными клетками просохли за ночь, их помещают в раствор Tris-EDTA с протеиназой K; протеиназа K используется для удаления всех белков с мембраны.Вы видите, что мембрану перевернули, чтобы убедиться, что все колонии полностью покрыты протеиназой K. Это позволит переварить значительную часть постороннего клеточного материала и белков. После 30-минутной инкубации с протеиназой K при 37 °C мембраны извлекают из раствора и оставляют высыхать на фильтровальной бумаге на ночь. После этого они готовы к следующему этапу — гибридизации.Меня зовут Вин фм. Я постдок в лаборатории Делонга. В MIT я использую технологию макромассивов для скрининга филогенетических маркеров, а также функциональных генов.Вы ознакомились с тем, как подготавливались библиотеки макромассивов. Теперь я подробно опишу оставшуюся часть процедуры проведения скрининга. Перед тем как приступить к работе с макромассивом, нам необходимо закрепить ДНК на самой мембране путем сшивания под воздействием УФ-излучения.Для этого мы используем УФ-линкер strata, помещаем его в систему, устанавливаем режим автоматического сшивания и запускаем процесс. После завершения сшивания я обычно разрезаю мембраны пополам. Это необходимо, так как гибридизация мембран будет проходить в пробирках для гибридизации, и разделение мембран пополам позволяет всей внутренней поверхности мембраны полностью контактировать с раствором для гибридизации.Как видите, мембрана идеально располагается внутри пробирки, не сворачиваясь. Таким образом, мембрана надежно размещена в пробирке для гибридизации. Следующим шагом я добавлю в нее буфер для гибридизации.Добавьте зонд, который находится в этой другой пробирке, предварительно нагретой до 60 °C. Это моя предпочтительная температура гибридизации. Прежде чем я это сделаю, точнее, в процессе, я объясню, что буфер для гибридизации был прислан нам производителем вместе с набором для детекции.Здесь указан гибридизационный буфер, который мы дополняем блокирующим реагентом. Также в состав входят фосфатный буфер, SDS, хлорид магния и хлорид натрия, а также некоторое количество мочевины. Отлично. Следующий шаг — поместить эту пробирку, содержащую мембрану в гибридизационном буфере и зонд, в гибридизационный печь, которую я настроил на 60 °C, и оставить ее для инкубации на ночь.После инкубации, которая в идеале должна длиться ночь, наступает время промыть мембраны для удаления несвязавшегося зонда. При приготовлении гибридизационного буфера и зонда опасные материалы не используются, поэтому их можно безопасно слить в раковину.Я возьму основной промывочный буфер, который также нагревается до 60 °C. Он прогревался при той же температуре, при которой мембраны гибридизировались в течение ночи. Промывка также будет проводиться при этой температуре.Обычно я провожу три промывки первичным промывочным буфером, при этом каждая инкубация длится примерно от 5 до 10 минут. Опять же, промывочный буфер не содержит радиоактивных или известных опасных химических веществ, поэтому после каждого цикла промывки его можно просто сливать в раковину. Таким образом, выполняется три промывки первичным промывочным буфером при 60 °C.Теперь мембраны готовы к повторной промывке, которая позволяет довести их до значения pH, подходящего для воздействия реагентов для ECF-детекции. Далее мы промываем мембраны в буфере для повторной промывки при комнатной температуре. Для извлечения мембран можно использовать пинцет, либо, соблюдая осторожность, переносить их рукой в перчатке, касаясь только обратной стороны или краев, чтобы не загрязнить мембраны частицами, которые могут находиться на ваших руках, даже в перчатках.Следует перенести мембраны в контейнер со вторичным промывочным буфером, который был заранее приготовлен и доведен до комнатной температуры. Расположите мембраны ровно. Иногда мембраны могут перекрывать друг друга, но это не имеет большого значения.Помните, что этот конкретный этап предназначен только для уравновешивания pH мембран. Затем оставьте их для инкубации. При желании можно использовать легкое перемешивание (раскачивание).Я не обнаружил, чтобы это было особенно полезно или вредно. Поэтому я снова оставляю образец на столе на 5–10 минут, после чего повторяю вторую промывку еще раз. Вторая стадия второй промывки завершена.Теперь пришло время подготовиться к детекции, разверните. Я отрезаю кусок пищевой пленки; мембраны будут уложены на пленку, реагенты для детекции нанесут сверху на мембраны, после чего пленку сложат обратно. Таким образом образуется удобный небольшой конверт для удержания реагента для детекции.Перед нами наши мембраны. Я сливаю избыток промывочного буфера на стопку сухих бумажных полотенец, после чего выкладываю мембраны на пленку Theran. Для работы используется заранее приготовленная смесь для ECF-детекции.Обычно их можно хранить в морозильной камере в течение нескольких месяцев; я просто наливаю реагенты на мембрану. Затем я складываю оставшуюся часть и оборачиваю её пищевой плёнкой.Затем я формирую подобие конверта, загнув концы или края, и закрываю весь процесс детекции алюминиевой фольгой. Я оставляю образец в таком виде также примерно на 5–10 минут. После этого наступает время слить химикаты для детекции из этого первого пакета.Вы заметили, что я закрепил часть пищевой пленки скотчем к лабораторному столу. Вам это может часто пригодиться, чтобы предотвратить слипание, которое неизбежно происходит с пленкой. Опять же, удобно сливать жидкость, промакивая ее стопкой бумажных полотенец, а затем разворачивать свежую, чистую пленку, которую вы заранее подготовили на столе.Итак, реагенты для детекции в основном удалены; мембраны готовы к инкубации в течение примерно двух часов для развития сигнала. Прошло два часа, и мы готовы зафиксировать сигнал на наших мембранах. Для этого мы сканируем мембраны с помощью флуоресцентного сканера, при этом, опять же, прикасаясь к мембранам только за края.Для удаления пузырьков воздуха, которые могут образоваться между мембраной и стеклом, рекомендуется использовать пипетку. Теперь можно приступать к сканированию. Задайте область сканирования на предметном стекле, соответствующую расположению наших мембран, и выполните сканирование на длинах волн 4 и 73 нм.Таким образом, при увеличении завершенного скана вы получите изображение, подобное этому. Здесь виден сигнал. Наличие двух противоположных точек всегда свидетельствует о положительном сигнале.Вот один пример, а вот второй. Таким образом, когда вы определили, в какой части мембраны находится сигнал, вам необходимо отследить, какому планшету и каким лункам соответствует этот конкретный сигнал. Это позволит определить, какой клон несет тот самый ген, который вы пытались идентифицировать в ходе вашего скрининга.После того как вы идентифицируете smid, вы сможете его найти. Одним из способов является секвенирование всей вставки smid с последующим поиском интересующего вас гена.

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Этот протокол описывает экран высокого пропускную способность для целлюлолитических деятельности от метагеномных библиотеки выражается в кишечной палочки. Экран урегулирования, основанного и высокой степенью автоматизации, и использует одну-пот в 384 химии и планшеты с окончательным считывания как измерения абсорбции.

Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Мы разработали всеобъемлющую, объективной генома экранов, чтобы понять геном наркотиков и генотипа и среды взаимодействия. Методы анализа этих мутантов коллекции представлены.

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

Источник: Kim, H. и др., Мультиферментный скрининг с использованием высокопроизводительной системы генетического ферментного скрининга. J. Vis. Exp .(2016)В этом видео демонстрируется метод генетического скрининга для обнаружения экспрессии ферментов с использованием метагеномных фосмидных библиотек и хромогенных субстратов. Потоковая цитометрия выявляет и изолирует отдельные клетки, образующие цветные продукты, что позволяет проводить высокопроизводительный отбор активных ферментных клеток.

Обнаружение экспрессии целевых ферментов в генетически модифицированных бактериальных клетках

В этой рукописи описывается автоматизированный подход к выбору размера геля для очистки фрагментов ДНК для секвенирования следующего поколения. Технология Ranger обеспечивает полную автоматизацию всего процесса загрузки агарозного геля, электрофоретического анализа и восстановления целевых фрагментов ДНК, что позволяет создавать высокопроизводительные и высококачественные библиотеки секвенирования нового поколения.

Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

В этой работе представлен метод высокопроизводительного скрининга с использованием универсальной системы генетического скрининга ферментов, которая теоретически может быть применена к более чем 200 ферментам. В данном случае единая система скрининга идентифицирует три различных фермента (липазу, целлюлазу и щелочную фосфатазу) путем простого изменения используемого субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат).

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

Метагеномика была использована для исследования микробиома силосного корма для крупного рогатого скота. Анализ проводили с помощью секвенирования дробовика. Этот подход был использован для характеристики состава микробного сообщества в корме для крупного рогатого скота.

Метагеномной Анализ силос

Выявление физических взаимодействий между генов и нормативных элементов сложной но способствовала хромосома конформации захвата методами. Эта модификация 4C-seq протокол смягчает ПЦР предвзятости, сведения к минимуму чрезмерного амплификации PCR шаблонов и максимально mappability чтений путем включения добавлением энзима ограничения дайджест шаг.

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

Технология CRISPR-Cas9 обеспечивает эффективный метод точного редактирования генома млекопитающих в любом типе клеток и представляет собой новое средство для выполнения генетических экранов генома. Здесь представлен подробный протокол, в котором обсуждаются шаги, необходимые для успешного выполнения объединенных экранов CRISPR-Cas9, в масштабах всего генома.

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Данная рукопись описывает подход к скринингу на основе клеток в масштабе генома для выявления внеклеточных взаимодействий рецепторов-лигандов.

Идентификация рецепторов поверхности клетки используя Геном-Шкала CRISPR/Cas9 Генетические экраны

В этом исследовании представлен пространственный мультиомный протокол Trekker–CUT&amp;Tag, сочетающий прямое пространственное штрихкодирование срезов ткани с одноклеточным мультиомным анализом. Этот подход позволяет одновременно пространственно разрешать профилирование экспрессии генов на одноклеточном уровне и модификацию гистонов H3K27ac, предоставляя механистические представления о регуляции генов в контексте микроанатомии тканей.

Пространственно разрешённое, интегрированное одноклеточное мультиомное профилирование транскриптома и эпигеномных мишень в замороженных срезах тканей

Изучите крупномасштабное нанесение колоний из метагеномных библиотек на нейлоновые мембраны с помощью роботизированных систем. Этот метод обеспечивает высокую точность и воспроизводимость при анализе микробных сообществ.

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Больше видео