Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Итак, наша цель состоит в том, чтобы инокулировать колонии из некоторых из этих метагеномных библиотек на мембранные фильтры, и каждый из этих фильтров может вместить 10 000 колоний. Так что то, что ром делает прямо сейчас, это накладывает этот нейлоновый фильтр на блок и как бы разглаживает его. Это, он в небольшом количестве жидкости, это просто бульон лурии для роста.

Затем он передаст эту увлажненную мембрану роботу, который автоматически привьет в эту мембрану 10 000 колоний. И робототехника необходима для такого рода процедур, потому что ни у одного человека на самом деле нет пациентов или точности, чтобы обнаружить 10 000 колоний на одной из этих мембран. Роботы — это одна из тех вещей, которые действительно продвинули науку о геноме, позволив выполнять очень повторяющиеся и небольшие пространственные операции с высокой точностью.

В настоящее время робот настраивает робота для подачи этих 3 84-луночных планшетов в каждую скважину в этих 3 84-луночных планшетах, содержащую отдельную колонию из метагеномной библиотеки. Прямо сейчас роботы стерилизуют инокуляционные иглы, которые они собираются использовать для обнаружения на мембране. Таким образом, он проходит через несколько различных растворов, один из которых на 70% состоит из этанола, как бы стерилизуют его, а затем эти инокуляционные иглы погружаются в планшет на 3 84 лунки, который содержит все колонии.

Теперь его стерилизуют и сушат на свету. После того, как иглы для инокуляции высохнут, пластина будет пропущена через робота. Каждая из этих колоний на самом деле запятнана и дублируется, что помогает в качестве контроля.

Таким образом, мы на самом деле ищем две идентичные колонии, которые демонстрируют сигнал от гибридизации. После того, как все эти колонии были замечены на фильтре. Опять же, его наносят на предзнаменательную пластину, которую вы видите здесь, а затем просто устанавливают 37 градусов по Цельсию на ночь.

Происходит следующее: каждая колония вырастает, и то, что вы видите, представляет собой массив из 10 000 колоний на фильтре. Конечно, каждая из этих колоний имеет много, много, много копий рекомбинантной ДНК, в данном случае метагеномной ДНК. Это из центральной части северной части Тихого океана, который мы сделали.

Далее Сальтрам перенесет эту мембрану в ряд растворов. Первый раствор, на который он переходит, — это основной раствор гидроксида натрия, который будет лизировать колонии. По сути, он растворяет клеточную стенку и освобождает ДНК, чтобы она могла, ДНК вступает в контакт с фильтром.

И вот что происходит здесь: все клеточные стенки всех бактерий в этих колониях растворяются, и ДНК теперь свободна. После пяти минут в гидроксиде натрия фильтры затем перелили. Это просто место для его отдыха, потому что дальше он будет погружаться в кипящий пар.

Итак, это вторая часть этапа лизиса. Во-первых, клетки были обработаны высокоосновным раствором гидроксида натрия и детергента дуд-сульфата натрия. Сейчас эти колонии подвергаются сильному нагреву, паровому нагреву до ста градусов по Цельсию.

Комбинация этого основания и детергента, а также это тепло полностью повлияет на клетки, и ДНК будет свободно находиться на фильтре. После пяти минут в паровой скорой помощи, горловина переведет фильтр в нейтрализующий раствор. Нейтрализующий раствор в основном нейтрализует всю эту основу, после чего фильтр будет высушен.

Итак, теперь это нейтрализующий раствор, и он находится в нейтрализующем растворе еще пять минут. Затем фильтр перекладывают на промокательную бумагу и дают ему высохнуть, как правило, в течение ночи. После того, как мембраны с клетками lys высушиваются в течение ночи, их помещают в раствор трисса, ЭДТА и протеазы К, а протеаза К удаляет весь белок, который находится на мембране.

Видите ли, ром перевернул его, чтобы убедиться, что все эти колонии покрываются протеазой К. Она будет переваривать много постороннего клеточного материала и белка. А после получасовой инкубации в протеазе К при 37 градусе С оболочки просто достают из раствора и сушат на промокательной бумаге на ночь. И тогда они готовы к следующему шагу, который называется гибридизацией.

Меня зовут Вин фм. Я работаю постдоком в лаборатории Делонга. В MITI используют технологию макроматриц для скрининга филогенетических маркеров, а также функциональных генов.

Вам показали, как были подготовлены эти библиотеки массивов макросов. Я проведу вас через остальную часть процедуры о том, как проводить скрининг. Вот макромассив, который мы, прежде чем продолжим, нам нужно закрепить ДНК на самой мембране путем перекрестного сшивания с помощью ультрафиолета.

Мы делаем это с помощью UV strata linker, помещаем его туда, устанавливаем его для автокросс-линка и начинаем. Итак, после того, как он был сшит, мне нравится разрезать мембраны на две половины. Я делаю это, потому что эти мембраны будут гибридизоваться внутри этих гибридизационных трубок, и разрезание их пополам позволяет полностью подвергнуть всю внутреннюю поверхность мембраны воздействию гибридизационного раствора.

Вы можете видеть, что мембрана идеально сидит внутри трубки, не переворачиваясь на себя. Итак, у нас есть мембрана, которая прекрасно размещена внутри гибридизационной трубки. Далее я собираюсь добавить к нему буфер гибридизации.

Содержащий щуп, который у меня есть в другой трубке, которая была предварительно нагрета до 60 градусов. Это моя предпочитаемая температура гибридизации. Итак, прежде чем я это сделаю, я объясню, что буфер для гибридизации отправлен нам вместе с нашим комплектом обнаружения производителем.

Там написано буфер для гибридизации, который мы дополняем блокирующим реагентом. Также в состав входят фосфатный буфер, SDS, хлорид магния и хлорид натрия, а также некоторое количество мочевины. Прекрасно. Итак, следующее, что я делаю, помещаю эту пробирку с буферной мембраной для гибридизации и зондом в печь для гибридизации, которую я установил на 60 градусов, устанавливаю ее и забываю для ночной инкубации.

Итак, после идеальной ночной инкубации пришло время промыть мембраны, чтобы удалить любой несвязанный зонд. При приготовлении гибридизационного буфера или зонда отсутствуют опасные материалы. Так что можно безопасно выливать его в раковину.

Я собираюсь взять свой основной буфер для стирки, который также нагревается при 60 градусах. Он хорошо нагревается при той же температуре, при которой мембраны гибридизуются в течение ночи. Я, его тоже буду стирать при той же температуре.

Итак, я обычно делаю три промывки с первичным буфером промывки с каждой инкубацией от пяти до 10 минут примерно в пять или 10 минут. И опять же, буфер для промывки - это нерадиоактивные известные опасные химические вещества после каждого цикла стирки, вы просто сбрасываете, сбрасываете их в раковину. Прошло три стирки, когда первичная промывка буферизировалась при 60 градусах.

Теперь мембраны готовы к вторичной промывке, которая приводит мембраны к необходимому pH для воздействия химических веществ, обнаруживающих ECF. Итак, далее мы промываем мембраны во вторичном буфере для промывки при комнатной температуре. Теперь вы можете использовать пинцет для удаления мембран или, если вы очень осторожны, вы можете использовать руку в перчатке и обрабатывать мембраны только с тыльной стороны или по краям, чтобы не испачкать мембраны какими-либо загрязнениями, которые могут быть на ваших, ваших руках или даже когда они надеты в перчатки.

Мы должны переложить мембраны в емкость, которая содержит вторичный буфер для промывки и довести до комнатной температуры. Просто положите его красиво и ровно. Иногда мембраны накладываются друг на друга, но это не так важно.

Помните, что этот конкретный шаг просто уравновешивает pH мембран. Затем вы позволяете ему инкубироваться. Вы можете немного покачаться, если хотите.

Я не нахожу это особенно полезным или вредным в любом случае. Поэтому я просто оставляю его на своем столе на пять-10 минут снова, а затем повторяю вторичную стирку во второй раз. Производится вторая промывка вторичной промывки.

Теперь самое время настроить на обнаружение, расширить. Итак, я продеваю немного сарановой пленки, и мембраны будут наложены на сарановую пленку с портом реагентов для обнаружения поверх мембран, а затем снова сложу сарановую пленку. И это создает красивый маленький мешочек для хранения реагента для обнаружения.

Здесь у нас есть мембраны. Я сливаю излишки буфера для стирки на несколько сухих бумажных полотенец стопкой и выкладываю мембраны на пленку Theran. У вас есть предварительно смешанное обнаружение ECF.

Такие обычно могут храниться в морозилке несколько месяцев подряд, я просто выливаю реактивы на мембрану. Я складываю остатки. Так что побежали по заворачиванию.

И я создаю небольшой мешочек, заправляя концы или края и защищая весь процесс обнаружения алюминиевой фольгой. И я оставляю это на пять-десять минут. Пришло время слить химикаты для обнаружения из этой первой сумки.

Вы заметили, что я, я приклеил часть пищевой пленки к своей скамейке. Вы, возможно, обнаружите, что это часто полезно для предотвращения такого рода прилипания, которое обязательно делает обертка cera. Опять же, полезно слить воду, выложив воду на стопку бумажных полотенец и развернув свежую, чистую, чистую пленку, которую вы предварительно положили на скамейку.

Итак, обнаруживающие химикаты по большей части исчезли, так что мембраны готовы к двухчасовой инкубации, чтобы дать сигналу развиться. Прошло два часа, и мы готовы обнаружить сигнал на наших мембранах. И я использую это, сканируя мембраны с помощью флуоресцентного сканера, опять же, работая только с мембранами по краям.

Что может оказаться полезным, так это использовать пипетку, чтобы раскатать любые пузырьки, которые образуются между мембраной и стеклом. Итак, мы готовы к сканированию. Установите область на лицевой панели, которая была покрыта нашими мембранами, и сканируйте с точностью 4 и 73 нанометра.

Таким образом, когда вы увеличите готовый скан, вы получите что-то похожее на это изображение. У вас есть сигнал прямо там. Когда у вас есть две противоположные точки, это признак положительного сигнала.

Вот один пример, вот второй. Таким образом, как только вы узнаете, какая часть мембраны содержит сигнал, вы затем проследите, какой пластине и каким колодцам соответствует конкретный сигнал. Это скажет вам, кто из них является носителем конкретного гена, который вы пытались идентифицировать с помощью своего экрана.

И как только вы определите смид, вы сможете искать себя. Один из способов состоит в том, чтобы просто секвенировать весь smid is insert и найти тот ген, который вас интересует.