дрозофила Количественная оценка нервно-мышечных соединений (NMJ): метод оценки морфологии и функции синапсов

- Во-первых, иммуноокрашивание личинок дрозофилы маркерами, которые выделяют различные аспекты NMJ или нервно-мышечных соединений. Это область, где окончание аксона мотонейрона контактирует с мышцей, и его морфология используется в качестве считывания синаптической функции.

Аксон заканчивается несколькими ветвями, которые образуют выпуклости, называемые бутонами. Нейротрансмиттеры высвобождаются из бутонов и вызывают сокращение мышц. Области высвобождения нейромедиаторов называются активными зонами. Здесь один маркер специфичен для синаптического белка, который очерчивает NMJ, а другой маркер — для белка, присутствующего в активных зонах.

Затем получите NMJ-изображения с помощью микроскопии и количественно оцените их морфологию с помощью полуавтоматического программного обеспечения для анализа изображений. Примените к изображениям предустановленный набор программных команд. Выходные файлы содержат проанализированные NMJ-изображения и результаты морфологии. Характеристики, которые могут быть измерены, включают количество и площадь поверхности бутонов, длину и количество ветвей NMJ, количество несоединенных отсеков NMJ и количество активных зон.

В следующем примере мы проанализируем морфологию NMJ дрозофилы, окрашенных DLG1, постсинаптическим маркером, и BRP, маркером активной зоны.

- Для этого протокола сгенерируйте стеки изображений NMJ и сохраните их как отдельные файлы TIFF, где канал 1 показывает окрашивание DLG1 или аналогичный маркер, а канал 2 показывает окрашивание BRP. Для начала создайте Z-проекции и гиперстеки файлов изображений NMJ. Откройте параметры плагина и выберите Drosophila NMJ morphometrics.

Теперь определите уникальную строку файла, которую микроскоп присвоил серии изображений при их хранении в формате TIFF. Это будет в конце имени изображения. Скопируйте и вставьте заданную строку до самой низкой плоскости и номера канала в уникальное окно настройки строки файла. Затем выберите подмакрос «Конвертировать в стек» и выберите каталог или папку, в которой находятся изображения.

Для каждого файла изображения создаются два новых файла с именами по умолчанию stack и flat stack, за которыми следует исходное имя изображения. Затем исходные файлы можно удалить, чтобы сэкономить место на диске. Затем в интерфейсе морфометрии Drosophila NMJ выберите определенный подмакрос ROI и выберите каталог файлов изображений.

Когда откроется первая проекция, выберите инструмент выделения от руки, затем с помощью мыши определите область, содержащую полный интересующий терминал NMJ. После выбора нажмите OK в окне определенного терминала. Продолжайте делать это до тех пор, пока терминалы NMJ не будут определены во всех проекциях. Макрос автоматически продвигает процесс. Для каждого файла изображения создается один новый файл с именами по умолчанию ROI, за которыми следует исходное имя изображения.

Чтобы количественно оценить признаки NMJ, сначала перейдите в интерфейс морфометрии Drosophila NMJ и установите масштаб. Например, если один пиксель изображения соответствует 0,72 мкм, установите масштаб пикселей равным 1 и масштабное расстояние равным 0,072. Затем выберите подмакрос «Анализ» и, если есть два изображения канала, также переключите «Ожидание». Нажмите OK и при появлении запроса выберите каталог файла изображения. Время обработки может составлять несколько минут на один синапс.

После анализа новые файлы изображений для каждого анализируемого синапса сохраняются в родительской папке, а количественные измерения — в файле results.txt. Проверьте все изображения и исключите изображения с ошибками сегментации.

Например, части синаптической окончания могут не быть включены в желтый контур. Части фона могут быть включены в синаптическую окончание. Синяя скелетная линия может выходить за пределы синаптической окончании. Активных зон может быть слишком много, или некоторые активные зоны могут остаться незамеченными.