Измерение жесткость на изгиб бактериальных клеток Использование оптической ловушки

Для определения жесткости на изгиб отдельных клеток E. coli сначала вырастите бактерии до экспоненциальной фазы, а затем закрепите их на поверхности химически обработанного покровного стекла. Позвольте уже прикрепившимся к поверхности клеткам расти дальше, чтобы у них сформировались гибкие концы. Затем введите поток диэлектрических бусин, захватите одну бусину и пригните ее к гибкому кончику клетки.

Заключительным этапом процедуры является изгиб клетки с помощью оптической ловушки и измерение полученных данных о вынужденном смещении. Жесткость изгиба клетки может быть рассчитана путем линейной аппроксимации данных о вынужденном смещении. Здравствуйте, я Стивен Вонг из лаборатории профессора Джошуа Шира в Институте интегративной геномики имени Луи Сиклера и на кафедре физики Принстонского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру изгиба отдельных клеток E. coli и измерения жесткости клеток. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения вклада различных внутриклеточных структур в механическую целостность бактериальных клеток. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры вырастите три миллилитра любых клеток e coli в среде LB до экспоненциальной фазы. Когда оптическая плотность клеток при 600 нм достигнет значения от 0.2 до 0.4, добавьте в культуру цефалексин в концентрации 50 мкг/мл на 15 минут для индукции филаментозного роста. В течение этих 15 минут изготовьте проточную камеру.

Прикрепите два кусочка двухстороннего скотча к предметному стеклу с зазором в 3 mm между ними, а сверху закрепите покровное стекло. Зазор между кусочками скотча образует канал для протока жидкости. Покройте покровное стекло PEI, введя с помощью микропипетки 10 µL 1% полиэтилена, разведенного в воде, в проточную камеру, и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем промойте камеру, пропустив 200 µL воды с одного конца и собирая ее с другого конца с помощью вакуума. После 15 минут культивирования бактерий в присутствии цефалексина центрифугируйте один мл клеток в микроцентрифуге и ресуспендируйте их в 200 µL LV с цефалексином. Затем снова, используя микропипетку с одного конца и вакуум с другого, введите 50 µL концентрированной клеточной культуры в камеру с покрытым покровным стеклом и инкубируйте в течение трех минут.

Затем промойте 50 µL среды Vel B с добавлением цефалексина. Для удаления неприкрепившихся клеток инкубируйте камеру при 37 °C от 30 минут до одного часа, чтобы прикрепившиеся клетки могли вырасти, прежде чем поместить их в установку для оптического захвата во время инкубации. Приготовьте бусины с полилизинным покрытием, инкубируя 3 µL полистирольных бусин диаметром 0,5 µm в 0,1% Polylysine, разведенном в воде, в течение 30 минут.

После завершения инкубации бусин промойте их трижды, центрифугируя в микроцентрифуге и повторно суспендируя в одном миллилитре воды, затем приступите к связыванию бусин с бактериями и измерению жесткости связывания клеток. Самым сложным аспектом данного протокола является способность обнаружить, локализовать и распознать подходящую клетку для измерения жесткости изгиба. Подходящей считается клетка с четко определенным закрепленным и свободным концами.

В проточной камере под микроскопом найдите клетку с четко зафиксированным концом. Некоторые клетки прикреплены только одним концом, и тогда изгибающая сила, приложенная к другому концу, приводит к повороту всей клетки, а не к ее изгибу. Чтобы найти подходящую клетку, быстро согните каждую клетку с помощью ловушки, используя движение предметного столика, управляемого джойстиком.

При обнаружении подходящей клетки разведите раствор микросфер в два раза в среде LB с цефалексином; с помощью пипетки внесите 30 µL раствора микросфер в один конец проточной камеры и аккуратно вытесните жидкость с другого конца, используя салфетку Kimwipe. С помощью оптической ловушки захватите свободно плавающую микросферу и прижмите ее к свободному концу клетки. Повторно промойте камеру с помощью микропипетки и салфетки Kimwipe, используя 50 µL цефалексина в LB для удаления неприкрепленных микросфер. Затем запустите специально написанную программу LabVIEW для приложения изгибающих сил к клетке и записи данных о вынужденном смещении.

Сначала откалибруйте отклик детектора путем сканирования прикрепленной микросферы по RA внутри луча детектирующего лазера и записи трехмерных сигналов напряжения PSD. Затем определите продольную ось клетки на изображении с микроскопа. После определения продольной оси перемещайте клетку ступенями в направлении, перпендикулярном этой оси, одновременно записывая пройденное расстояние и смещение микросферы относительно центра оптической ловушки.

Наконец, переведите значения смещения в приложенную силу, используя ранее измеренную жесткость ловушки, и сохраните результат. Смещение и сила кончика, сохраненные в файл, представляют собой данные о принудительном смещении одной клетки. Наклон этой прямой соответствует изгибной жесткости клетки.

Мы только что продемонстрировали вам, как совместить изгибную жесткость e coli с оптической ловушкой. При использовании данной процедуры важно помнить о необходимости подобрать подходящую клетку с четко определенными закрепленным и свободным концами. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.