Измерение жесткость на изгиб бактериальных клеток Использование оптической ловушки

Чтобы определить жесткость на изгиб отдельных клеток кишечной палочки, сначала вырастите бактерии до экспоненциальной фазы, а затем прикрепите их к химически обработанной поверхности скольжения. Пусть клетки уже прикрепляются к поверхности, растут дальше, чтобы у них развились гибкие концы. Далее влейте в диэлектрические шарики, захватите бусину и пригните ее к гибкому кончику ячейки.

Заключительным этапом процедуры является изгиб ячейки с оптической ловушкой и измерение полученных данных о принудительном перемещении. Жесткость ячейки на изгиб может быть рассчитана путем линейной подгонки к данным принудительного перемещения. Здравствуйте, я Стивен Вонг из лаборатории профессора Джошуа Шера в Институте интегративной геномики Луиса Сиклера и на физическом факультете Принстонского университета.

Сегодня мы покажем вам в процедуре изгиба отдельных эко-ячеек и сопряжение жесткости клеток. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения вклада различных внутриклеточных структур в механическую целостность бактериальных клеток. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, вырастите три миллилитра любых клеток кишечной палочки в средней и экспоненциальной фазе LB. Как только клетки достигнут оптической плотности на уровне 600 нанометров от 0,2 до 0,4, добавьте в культуру 50 микрограммов цефалексина на миллилитр в течение 15 минут, чтобы вызвать нитевидный рост. В течение этих 15 минут сделайте проточную камеру.

Прикрепите два куска двустороннего скотча с трехмиллиметровым зазором между частями к предметному стеклу и сверху заклейте скотчем покровное стекло. Зазор между кусочками ленты создает канал для стекания жидкости. Покройте крышку ПЭИ, введя 10 микролитров 1%-ного полиэталина, разведенного в воде, в проточную камеру с помощью микропипетки и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем промыть, протекав 200 микролитров воды на одном конце камеры и собрав на другом конце с помощью вакуума. После 15 минут выращивания бактерий в присутствии цефалексина раскрутите один миллилитр клеток в микроцентрифуге и повторно суспендируйте в 200 микролитрах ЛЖ с цефалексином. Затем снова используйте микропипетку на одном конце и пропылесосьте на другом конце, чтобы влить 50 микролитров концентрированной клеточной культуры в камеру, где в течение трех минут будет инкубироваться крышка с покрытием.

Затем умыться 50 микролитрами Вел В с добавлением цефалексина. Чтобы удалить неприкрепленные клетки, инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия в течение от 30 минут до одного часа, чтобы дать прикрепленным клеткам вырасти, прежде чем помещать их на оптический инструмент захвата во время инкубации клеток. Приготовьте гранулы, покрытые полилизином, путем инкубации трех микролитров полистирольных шариков диаметром 0,5 микрометра в одном из 0,1% полилизина, разведенных в воде, в течение 30 минут.

Когда бусины закончат инкубацию, промойте их три раза, вращая в микроцентрифуге и суспензии в одном миллилитре воды, приступайте к связыванию бусин с бактериями и измеряйте жесткость связывания клеток. Самым сложным аспектом этого протокола является возможность определить, найти и распознать хорошую ячейку для измерения изгиба, жесткости. А хорошая клетка — это ячейка с четко определенным застрявшим концом и свободным конечным местом.

В проточной камере на микроскопе ищите ячейку с четко выраженным застрявшим концом. Некоторые ячейки прикреплены только на одном конце, и изгибающая сила на другом конце приводит к тому, что вся ячейка вращается, а не изгибается. Чтобы найти подходящую ячейку, быстро согните каждую ячейку с помощью ловушки, используя движение сцены, управляемое джойстиком.

Когда подходящая клетка будет найдена, разведите раствор шариков в два раза в фунт с цефалексином, добавьте 30 микролитров раствора шариков в проточную камеру путем пипетирования в один конец и осторожно вытекав с другого конца салфеткой Кима, оптически захватите плавающую бусину и прикоснитесь ею к свободному кончику клетки. Снова промойте камеру микропипеткой и с помощью белой салфетки Kim с 50 микролитрами цефалексина в LB удалите неприкрепленные бусины. Затем запустите специально написанную программу лабораторного просмотра, чтобы применить изгибающие силы к ячейке и записать данные о принудительном перемещении.

Во-первых, откалибруйте отклик детектора путем сканирования прикрепленной бусины в лазерном луче обнаружения и записи сигналов напряжения 3D PSD. Затем определите длинную ось клетки на изображении под микроскопом. После определения длинной оси ячейки перемещайте ячейку ступенчато в направлении, перпендикулярном длинной оси, при этом перемещая запись клетки, перемещаемое расстояние и смещение шарика от центра оптической ловушки.

Наконец, преобразуйте значения смещения в приложенную силу, используя ранее измеренную жесткость ловушки, и сохраните. Смещение наконечника и усилие для подачи здесь являются данными о принудительном смещении для одной ячейки. Наклон этой линии — это жесткость ячейки на изгиб.

Мы только что показали вам, как совместить изгибающую жесткость кишечной палочки с оптической ловушкой. При использовании этой процедуры важно помнить о том, что нужно найти хорошую клетку с четко выраженным застрявшим и свободным концом. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.