Дрозофила in vivo Визуализация кальция: метод функциональной визуализации активности нейронов

- Чтобы выполнить визуализацию кальция в нервной системе дрозофилы in vivo, нацельтесь на экспрессию генетически кодируемого индикатора кальция, такого как GCaMP, на интересующие нейроны. Когда нейроны активируют потенциал действия, быстрая деполяризация мембраны приводит к открытию потенциал-зависимых кальциевых каналов, что приводит к притоку внеклеточного кальция в клетку.

GCaMP представляет собой гибридный белок, в котором усиленный зеленый флуоресцентный белок, или EGFP, модифицируется и сливается с M13-фрагментом легкой цепи миозина на N-конце и с кальций-связывающим белком, кальмодулином, на C-конце. Кальций связывается с кальмодулином, вызывает конформационные изменения в GCaMP, вызывая увеличение флуоресценции белка.

Чтобы изобразить изменения флуоресценции GCaMP в качестве показателя активности нейронов in vivo, обнажите область нервной системы с ожидаемой активностью. Затем используйте флуоресцентный микроскоп, который может фиксировать динамику GCaMP и оснащен установкой подачи стимула. Подайте стимул, например, запах, одновременно регистрируя флуоресценцию GCaMP в реагирующих нейронах.

В примере протокола мы увидим, как функциональная визуализация GCaMP используется для визуализации реакций грибовидных тел мозга во время обонятельного ассоциативного обучения.

- Для визуализации показателей кальция на основе GFP настроить лазер многофотонного микроскопа, оснащенного инфракрасным лазером и объективом погружения в воду, установленного на виброизолированном столе, на длину волны возбуждения 920 нанометров, и установить полосовой фильтр GFP. С помощью ручки грубой регулировки по оси Z просканируйте ось Z, чтобы найти интересующую область мозга. Используйте функцию обрезки, чтобы сфокусировать сканирование только на интересующей области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и поверните вид сканирования так, чтобы передняя часть головы была обращена вниз. Затем отрегулируйте размер кадра до 512 на 512 пикселей и выберите область для сканирования, учитывая рассчитанное время сканирования для каждого кадра, чтобы достичь частоты кадров не менее 4 Гц.

Для визуализации переходных процессов кальция с запахом запустите предварительно запрограммированный макропакет, способный связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха, и начните измерение в программном обеспечении микроскопа в течение 6,25 секунд, чтобы установить базовое значение F0. В системе подачи запаха подайте 2,5-секундный стимул запаха, обозначенный здесь загоранием светодиодов, который запускается открытием и закрытием клапанов определенного чашечного стакана, за которым следует 12,5-секундная запись в конце смещения запаха. Затем повторите подачу второго и третьего одоранта таким же образом.

Чтобы выполнить ассоциативное обусловливание в этой системе, используйте управляемую компьютером систему доставки запаха, которая представляет условный стимул плюс запах в течение 60 секунд вместе с 12 90-вольтовыми электрическими разрядами. После 60-секундного перерыва предъявите раздражитель состояния за вычетом только запаха в течение 60 секунд без поражения электрическим током. Снова измерьте переходные процессы кальция, вызванные запахом, после тренировки, повторив протокол стимуляции запаха перед тренировкой через 3 минуты после окончания фазы тренировки. Затем сохраните файлы изображений в подходящем формате для последующего анализа изображений.