Скрининг химической токсичности на основе эмбрионов: оценка влияния на развивающиеся эмбрионы рыбок данио-рерио

- Начните с добавления 5 эмбрионов среды E3 в каждую лунку 96-луночного планшета и удалите излишки среды с помощью пипетки. Добавьте в каждую лунку среду Е3, содержащую канамицин, чтобы предотвратить загрязнение. Дайте эмбрионам расти при температуре 28 градусов по Цельсию.

Разбавьте интересующее соединение подходящим растворителем, таким как ДМСО, для приготовления нескольких концентраций или доз и проверьте влияние каждой дозы на развивающиеся эмбрионы. Как только эмбрионы достигнут желаемой стадии, пипетируйте каждый стоковый раствор в отдельные лунки. Накройте тарелку крышкой и аккуратно покрутите ее, чтобы перемешать содержимое. Пусть эмбрионы в лунке растут при температуре 28 градусов по Цельсию.

В желаемое время эмбрионального развития поместите луночный планшет под подходящий микроскоп для изучения фенотипа эмбрионов. Вы можете наблюдать такие фенотипы, как потеря глаз, задержка роста или потеря меланоцитов у развивающихся эмбрионов. В следующем протоколе мы протестируем библиотеку соединений для низкомолекулярных ингибиторов развития переднего мозга.

- Библиотеки малых молекул обычно поставляются в виде 96-луночной исходной пластины, при этом каждое соединение хранится в ДМСО в виде запаса длиной 10 миллимоляров. Примерно за 60 минут до того, как эмбрионы достигнут желаемой стадии, разморозьте соответствующее количество 96-луночных планшетов, содержащих аликвоты малых молекул. Обратите внимание на серийный или другой идентификационный номер исходных номеров. Чтобы свести к минимуму образование конденсата на пластинах, разморозьте в камере высыхания, содержащей дририт.

Кратковременно раскрутите планшеты в настольной центрифуге, оснащенной адаптером для многолуночных планшетов. Снимите алюминиевую уплотнительную ленту с исходной пластины. С помощью 12-канальной пипетки разбавьте соединения в исходной пластине до нужной концентрации с помощью ДМСО. В этом протоколе мы используем конечную концентрацию 0,5 миллимоляра и добавляем 4,75 микролитра ДМСО для разбавления 10-миллимолярной стоковой пластины.

Когда эмбрионы в 96-луночном планшете достигнут желаемой стадии, используйте 12-канальную пипетку для переноса 2,5 микролитров соединений с исходных планшетов в пластины-реципиенты, содержащие эмбрионы. Накройте пластины, содержащие эмбрионы и соединения, крышками и запишите идентификационный номер исходных пластин на пластинах для эмбрионов. Перемешайте пластины, аккуратно поворачивая, и поместите их в инкубатор с температурой 28,5 градусов Цельсия. Накройте каждую исходную пластину, содержащую неиспользованные мелкие молекулы, алюминиевой герметизирующей лентой и поместите в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения.

Прежде чем выполнять визуальный скрининг, сформулируйте конкретный критерий попадания. Например, при скрининге низкомолекулярных ингибиторов развития переднего мозга попадание может быть соединением, которое приводит к потере переднего мозга. Отсутствие глаз является легким визуальным индикатором потери переднего мозга и не требует флуоресценции для анализа.

В желаемые моменты развития извлеките из инкубатора 96-луночные планшеты, содержащие обработанные компаундом эмбрионы, и исследуйте каждую лунку под стереомикроскопом. При скрининге на низкомолекулярные ингибиторы развития переднего мозга исследуйте пластины через 28 часов на предмет потери глаза как маркера торможения развития переднего мозга. Запишите идентичность планшета и местоположение лунки для любой лунки, в которой по крайней мере 3 из 5 эмбрионов демонстрируют предписанный фенотип попадания.

Поместите планшет на 96 лунок обратно в инкубатор. Подтвердите потерю глаз и переднего мозга через 48 часов. Несмотря на то, что у эмбрионов не будет переднего мозга, они доживут как минимум до четырех дней. Подтвердите потенциальное попадание путем повторного тестирования эффектов соединения при нескольких дозах. Для каждой дозы 10 эмбрионов тестируют в 0,5 миллилитрах среды Е3 в формате 48-луночных планшетов.

Время добавления соединения для повторного тестирования должно быть идентично времени первоначального скрининга. Попадание подтверждается, когда вызванный фенотип воспроизводится дозозависимым образом при повторном тестировании соединения. Наконец, определите попавшее соединение из базы данных малых молекул в химической библиотеке.