Таргетная абляция печени: индуцирование гибели гепатоцитов с помощью метронидазола у трансгенных личинок данио-рерио

- Растворите метронидазол в яичной воде, содержащей растворитель ДМСО, и добавьте фенилтиомочевину, которая препятствует образованию пигмента у эмбрионов. Перенесите несколько личинок соответствующего возраста на лечебные и контрольные пластины. Далее добавьте нужную концентрацию раствора метронидазола в тестовую пластину и яичную воду, содержащую ДМСО, в контрольную пластину.

Пусть личинки в обеих пластинах растут при температуре 28 градусов по Цельсию. Трансгенные личинки продуцируют нитроредуктазу только в гепатоцитах, что превращает метронидазол в цитотоксический препарат, что приводит к гибели только целевых гепатоцитов. После обработки удалите раствор метронидазола из лечебной пластины и промойте эмбрионы яичной водой.

Добавьте трикаин для обезболивания личинок и исследуйте их под эпифлуоресцентным микроскопом на предмет тяжелой абляции гепатоцитов — разрушения клеток печени. Вы будете наблюдать гораздо меньшую печень у пациентов, получавших лечение, чем у лиц контрольной группы. В примере протокола мы будем использовать метронидазол для абляции гепатоцитов у трансгенных личинок данио-рерио для изучения регенерации печени.

- Пересадите до 100 эмбрионов в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 25 миллилитров яичной воды, и поставьте чашку при температуре 28 градусов Цельсия. Чтобы подавить пигментацию, добавляйте ПТУ в культуру в течение 10 часов после оплодотворения. Через 80 часов после оплодотворения обезболите личинок трикаином и используйте эпифлуоресцентный микроскоп для сбора положительных личинок CFP, оставив только животных с печенью аналогичного размера

Затем замените воду с трикаином для яиц свежей яичной водой с добавлением PTU и верните личинок рыбок данио-рерио с положительным результатом CFP в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия. Чтобы обработать личинок данио-рерио МТЗ, сначала разделите соответствующее количество личинок на два разных сосуда для культуры. Подопытную группу личинок выдерживают в растворе свежеприготовленного МТЗ, а контрольную группу – в яичной воде с добавлением ДМСО.

Накройте опытную группу алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоинактивацию МТЗ, и инкубируйте обе группы личинок данио-рерио при температуре 28 градусов Цельсия. По окончании периода абляции удалите раствор МТЗ с пластин и два или три раза промойте обработанную МТЗ лаву 25 миллилитрами яичной воды и взбалтывайте, сбрасывая яичную воду после каждой промывки. После последнего промывки обездвижите личинки с половиной концентрации трикаина, ранее использованной для предотвращения отека сердца и гибели личинок, обработанных МТЗ. Затем используйте фильтр CFP на эпифлуоресцентном микроскопе для оценки уровня абляции гепатоцитов на основе относительного размера печени лавы, обработанной МТЗ. Рассмотрим рыбок данио-рерио с крупной печенью, составляющей от 0% до 5% личинок, которые не были абляционированы, рыбок среднего размера, представляющих от 10% до 20% личинок, подлежащих частичной абляции, и рыбок с очень мелкой печенью, представляющей от 80% до 90% личинок, подлежащих полной абляции.