Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 3:02 мин. • April 30th, 2023
- Один из подходов к определению функции гена заключается в том, чтобы подавить его экспрессию и наблюдать за эффектом. Морфолигомеры часто используются в исследованиях нокдауна на рыбках данио. Морфолино представляет собой синтетическую ДНК-подобную молекулу длиной около 25 оснований, которая подавляет экспрессию целевых генов.
Для лечения морфолино поместите обезболенную рыбу с частично ампутированным хвостовым плавником на инъекционную пластину и поместите пластину под стереомикроскоп. Вводите только дорсальную сторону, в то время как неинъецированная вентральная сторона действует как контроль. Morpholinos могут функционировать двумя способами в зависимости от последовательности, на которую они нацелены. Во-первых, они соединяются с сайтом начала трансляции на мРНК и предотвращают синтез белка, блокируя трансляцию.
Во-вторых, он может связываться с интрон-экзонным соединением на пре-мРНК и предотвращать надлежащий сплайсинг, что приводит к дефектному транскрипту, который будет разрушаться клеткой. Позже осмотрите хвостовые плавники на предмет выроста. Различия между возобновлением роста обработанных и необработанных областей указывают на то, что целевой белок играет роль в регенерации плавников. В этом протоколе мы будем использовать морфолино как часть анализа регенерации хвостовых плавников.
- За день до инъекции морфолино сделайте инъекционную пластину с 2% агарозой с вырезом на одном конце лунки, что поможет стабилизировать рыбу для процедуры инъекции. Непосредственно перед введением разведите помеченный флюоросцеином морфолино в воде, свободной от РНКазы и ДНКазы, до нужной концентрации и инкубируйте его на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. Загрузите заранее подготовленную инъекционную иглу и отрежьте кончик под углом.
Далее обезболите рыбу и поместите ее на инъекционную пластину. Удалите всю лишнюю жидкость и поместите пластину на предметный столик стереомикроскопа. Ориентируйте иглу как раз дистальнее костного луча.
Осторожно введите иглу в регенеративную ткань дистальнее каждого костного луча и надавите дистально до тех пор, пока не окажется в бластеме. Когда игла будет правильно локализована, следуйте указаниям системы микроинъекций и введите каплю морфолино объемом пять нанолитров за одну инъекцию. При каждой инъекции можно заметить желтую затяжку раствора морфолино, что помогает локализовать инъекцию до бластемы. Работая дорсально от средней линии, вводите примерно 75 нанолитров морфолина на каждый костный луч на дорсальной стороне, оставляя вентральную сторону в качестве только электропорационного контроля.