Экстракция ДНК из хвостовой клипсы: метод, используемый в генотипировании рыбок данио

- Начните процедуру с того, что положите взрослую рыбу под наркозом на стопку впитывающей бумаги. Теперь с помощью стерильного лезвия бритвы разрежьте хвостовой плавник и быстро перенесите рыб в аквариум с пресной водой для восстановления. Перенесите хвостовой зажим в чистую трубку, содержащую буфер для лизиса. Буфер для лизиса содержит неионогенные детергенты, которые растворяют плазматическую мембрану и ядерную мембрану клетки. Буфер также содержит фермент под названием протеиназа К, который расщепляет белки и обеспечивает высвобождение ДНК в лизат. Он также разрушает нуклеазы, защищая ДНК от расщепления нуклеаз.

Теперь оставьте трубки с хвостовыми зажимами в инкубаторе на ночь, чтобы полностью разрушить ткань при температуре 55 градусов Цельсия при непрерывном вращении. Затем нагрейте пробирку до 95 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы инактивировать протеиназу К. Центрифугируйте пробирку, чтобы гранулировать непереваренный материал и перенести надосадочную жидкость, содержащую ДНК, в другую пробирку. Добавьте спирт для осаждения ДНК и снова центрифугируйте для сбора ДНК в грануле. В следующем протоколе мы выделим ДНК из хвостовой клипсы взрослой рыбки данио и из целого эмбриона.

- В день подготовки ДНК добавьте в буфер для лизиса свежую протеиназу К в концентрации 1 миллиграмм на миллилитр. Ткань может быть собрана у взрослой рыбы с помощью зажима для плавников или у эмбриональной рыбы.

Во-первых, обезболите рыб в растворе трикаина. Подождите, пока жаберные движения замедлятся. Затем положите рыбу на стопку салфеток и стерильным лезвием бритвы отрежьте небольшой кусочек хвостового плавника длиной примерно от 2 до 3 миллиметров. Быстро поместили рыбок в промаркированный резервуар с пресной водой для восстановления.

Возьмите зажим для плавника со стерильным наконечником для пипетки и перенесите его в пробирку, наполненную сотней микролитров буфера для лизиса ДНК. Обязательно промаркируйте как аквариум с животным, так и пробирку. Инкубируйте все собранные ткани не менее четырех часов и до ночи при температуре 55 градусов Цельсия.

После инкубации инактивируйте протеиназу К, нагревая трубки при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут. Эти образцы следует использовать для ПЦР немедленно, но также можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до трех месяцев.