Двухфотонная лазерная аксотомия: метод повреждения аксонов у эмбрионов рыбок данио и наблюдения за восстановлением аксонов

- Поместите интересующие эмбрионы в фенилтиомочевину, PTU, раствор Рингера для подавления образования пигмента, которое начинается через 24 часа после оплодотворения. Это делает развивающуюся анатомию более заметной, что необходимо для проведения данной процедуры. Перенесите эмбрион под наркозом трикаина в камеру визуализации. Поместите сверху предметное стекло и рассмотрите его под микроскопом. Сосредоточьтесь на травмируемом аксоне, который виден под 488-нанометровым лазером, потому что он трансгенетически экспрессирует GFP.

Сделайте предварительное изображение сайта. Затем посмотрите на аксон с помощью лазера с яркостью 910 нанометров, который заставляет GFP флуоресцировать красным цветом. Увеличьте интенсивность этого лазера, чтобы травмировать целевую область, не затрагивая окружающие ткани. Этот процесс называется аксотомией. Сделайте новый снимок с помощью первого лазера, чтобы подтвердить аксотомию, которая выглядит как разбросанные обломки. В следующем протоколе мы выполним аксотомию периферических сенсорных аксонов у эмбрионов рыбок данио-рерио с помощью двухфотонного лазера.

- Если в вашей лаборатории нет специально изготовленного двухфотонного эндоскопа, конфокальный двухфотонный микроскоп Zeiss 510 также можно использовать для разрыва аксонов. Мы начинаем с того, что помещаем установленный эмбрион на сцену и фокусируем его с помощью 25-кратного водяного объектива. Затем включите два фотонного и аргонового лазера в режиме многодорожечности, чтобы можно было переключаться с одного на другой.

Хотя оба лазера используются для обнаружения GFP, двухфотонное излучение визуализируется красным цветом, а излучение аргонового лазера — зеленым, чтобы различать их. Используйте аргоновый лазер, чтобы определить аксон, который нужно ранить. В разделе «Настройки Z» отметьте первый и последний оптические участки, сделайте конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию стека Z.

Выключите аргоновый лазер и включите двухфотонный лазер. Сканируйте с интенсивностью пропускания около 9%, чтобы убедиться, что аксон все еще находится в фокусе. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы инструмент «Обрезка» был доступен. Используйте инструмент «Обрезка» для увеличения области интереса. Обычно мы увеличиваем масштаб примерно до 70 раз. Выберите область аксона, которую нужно травмировать, и сфокусируйте внимание на этой области. Масштаб можно проверить на вкладке Режим.

Затем на вкладке Каналы измените интенсивность двух фотонов с примерно 9% пропускания на 15% или 30%. Чтобы активировать новые настройки, нажмите кнопку «Быстрый XY», а затем нажмите «Быстро остановить», чтобы избежать избыточного урона. Аксон следует рассматривать как разбросанный мусор, если процедура сработала. Наконец, чтобы убедиться, что аксон действительно был поврежден, переключитесь обратно на аргоновый лазер с 488 нанометровым напряжением. Возьмите еще одно конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию стеков Z.