Микробных сообществ в природе и лаборатории - Интервью

Меня зовут Эд ДеЛонг, я профессор Массачусетского технологического института. На самом деле я занимаю должности одновременно на факультете гражданского и экологического строительства и на факультете биологической инженерии, что может показаться необычным сочетанием, так как моя деятельность охватывает две разные области. Один из аспектов наших исследований связан с окружающей средой и, в частности, с микроорганизмами: тем, как они влияют на окружающую среду и как среда влияет на них — это и есть гражданская и экологическая часть нашей программы.

Другое направление наших исследований больше связано с биологической инженерией. Что заставляет микробов функционировать? Как они устроены?

Как различные части, из которых состоят микробы, или микробные сообщества, взаимодействуют друг с другом синергично? Таким образом, своего рода союз между этими двумя областями работает довольно эффективно. Моя собственная специализация — общая микробиология в сочетании с океанографией.

Я получил степень бакалавра по бактериологии в Калифорнийском университете в Дэвисе, а затем степень доктора философии (PhD) в Институте океанографии Скриппса. Моя докторская степень, как ни странно, была получена по специальности «морская биология».

И вот я в MIT. Как это произошло? Область микробиологии меняется очень стремительно.

Одним из факторов, оказавших огромное влияние на наше современное понимание микробов, стали технологические достижения в области геномики. Как правило, микроорганизмы крайне трудно идентифицировать при изучении под микроскопом. Они различаются по форме и размеру, однако эти характеристики мало что говорят о том, что это за организм и какова его функция.

И поэтому обычно микробиологи были практически ограничены изучением микробов в лаборатории, что оказалось невероятно эффективным подходом. Это своего рода развитие медицинской микробиологии. Таким образом, вы можете выделить микроба из окружающей среды точно так же, как вы можете выделить химическое вещество.

И как только вы получите этот чистый микроб, этот чистый вид микроорганизмов, вы сможете изучить его фенотип, характеристики и различные свойства, которые позволяют ему функционировать в окружающей среде и так далее. Однако в этом подходе есть две проблемы с точки зрения понимания всего микробного мира. Дело в том, что микробы в лаборатории не всегда ведут себя так же, как они могли бы вести себя в естественной среде.

Другая, еще более серьезная проблема заключается в том, что большинство видов микроорганизмов крайне трудно культивировать в искусственных условиях. «Микробные зоопарки», которыми мы располагаем в лаборатории, обычно представляют лишь около 0,1% от всего природного разнообразия. Таким образом, существует огромный пласт микробного мира, который мы до сих пор не смогли вырастить в лаборатории и, следовательно, не понимаем.

И все же это составляет огромную часть биомассы в природе. Существует множество причин, почему это важно. Но одна из главных заключается в том, что микробы являются, если хотите, двигателями трансформации энергии и вещества в природе.

Таким образом, потоки таких веществ, как парниковые газы, или потоки энергии в экосистемах, которые огромны по своим масштабам в отношении некоторых из этих газов — мы говорим о гигатонных потоках в год — фактически опосредуются видами микробов по всему миру; несмотря на их малый размер, именно численность и повсеместное распространение микробиологического мира на нашей планете обеспечивают перемещение огромных масс вещества и энергии.

И это одна из веских причин для изучения микробов в их естественной среде, понимания их в природе. Когда на первый план вышла геномика, секвенирование полных микробных геномов становилось всё проще и дешевле. Разумеется, это начало происходить примерно в середине девяностых.

И когда это начало происходить, люди осознали, что те же самые методы можно использовать для изучения свойств геномов микробов в естественной среде, даже не прибегая к их культивированию. В некотором смысле это стало развитием более ранних исследований, проведенных Карлом Вузом и Нормом Пейсом. В середине восьмидесятых Норм Пейс понял, что может идентифицировать микробы, не выращивая их в культуре.

Это осуществлялось путем сбора биомассы из любого микробного биотопа с последующей экстракцией дДНК или РНК. Из этих нуклеиновых кислот можно было, например, секвенировать таксономически информативные молекулы, такие как рибосомальные РНК. Таким образом получался список различных рибосомальных РНК.

Они почти как штрихкоды для конкретных таксономических типов. С их помощью можно идентифицировать типы микробов в любой конкретной среде обитания. Ограничением данного подхода является то, что в вашем распоряжении оказывается только ген 16S рРНК.

Это позволяет определить, какой микроорганизм присутствует, но не дает точного представления о его деятельности. Теперь, благодаря применению геномики, этот процесс можно вывести на новый уровень: вы можете выделить нуклеиновые кислоты практически из любой микробиологической среды, которая придет вам в голову, используя различные методы. Выделяйте либо крупные фрагменты генома, что и будет продемонстрировано в некоторых экспериментальных протоколах, которые мы представим сегодня.

Кроме того, можно фрагментировать эту ДНК на мелкие части и провести дробовое секвенирование. Проще всего представить это как получение списка всех компонентов всех микробов, составляющих данное сообщество. И этот список компонентов был недоступен нам ранее.

Таким образом, на основании этого списка компонентов мы можем детально разобрать состав присутствующих микробов и определить некоторые из их потенциальных функций. В конечном счете мы формулируем гипотезы, которые затем можем проверить биохимическими методами, физиологическими методами, а также возвращаясь к исследованию окружающей среды и отслеживая гены в пространстве и времени.

Вся эта развивающаяся область, которая объединяет геномику с экологическими подходами, в настоящее время называется метагеномикой или экологической геномикой. Сегодня подобные исследования проводятся во многих различных средах обитания: в почвах, в сельскохозяйственных угодьях, в океане. Одно из первых и крупнейших исследований такого типа было проведено Крейгом Вентером в Саргассовом море, а также, что немаловажно, исследованием микробиома человека.

Многие могут этого не осознавать, но с человеческим организмом связано больше микробных клеток, чем собственных человеческих клеток. Микробов примерно 10¹⁴, а нас только 10¹³. Поэтому я иногда говорю, что Бог, должно быть, испытывал необычайную привязанность к микробам, раз их больше, чем нас.

Но эти концепции действительно важны. Подумайте о нас. Мы никогда не бываем одиноки.

Мы всегда являемся носителями микробного сообщества, которое, вероятно, выполняет множество различных функций. Сейчас имеются данные о том, что при некоторых расстройствах, например, при ожирении, микробный компонент может оказывать значительное влияние на человеческий фенотип в целом, а также на то, сколько энергии мы извлекаем из источников пищи. Таким образом, мы представляем собой живую систему, состоящую не только из нас самих, но и из симбионтов, которых мы переносим с собой.

Новые подходы с использованием геномики позволяют нам начать детально изучать те аспекты биологического мира, которые мы не могли исследовать ранее. В этом и заключается их сила. То, что происходит в данной области сейчас, — это не просто составление списка компонентов, а переход к пониманию того, что здесь протекают реальные динамические процессы.

Первоначально, когда началось секвенирование геномов, последовательность одного генома рассматривалась как единая сущность: например, имея очищенный штамм микроба, можно было определить последовательность, скажем, 2 миллионов оснований или пар оснований, составляющих этот геном. И казалось, что это очень фиксированная и статичная структура. Однако при изучении природы мы обнаруживаем, что понятие одного-единственного штамма микроба в действительности встречается крайне редко.

При изучении этих природных микробных популяций обнаруживается определенная закономерность, своего рода геномная тема, вокруг которой, если хотите, формируется вид. Однако в любой конкретной популяции присутствует множество вариантов, множество вариаций этой темы, множество штаммов. И сейчас мы начинаем понимать, что геномы не являются статичными объектами, они постоянно меняются.

Они динамичны. Фактически, это происходит и в популяциях. Таким образом, можно представить, что при незначительных изменениях окружающей среды, связанных с питательными веществами, температурой или соленостью, определенная доля вариантов в популяции может реагировать на эти изменения несколько лучше.

И происходит постоянный сдвиг, но и они, в свою очередь, также меняются. Таким образом, вариативность непрерывно обеспечивается нейтральным дрейфом, после чего на нее воздействует отбор. Это дает иное, более динамичное представление о том, что такое геномы.

Это не просто статичная картина генома, это скорее похоже на просмотр кинофильма. И одна из сильных сторон новых исследований заключается в том, что мы начинаем получать стоп-кадры, которые позволяют собрать в единое целое картину того, как эволюционируют геномы, что это означает с точки зрения фенотипа организма, его реакции на окружающую среду, а также его влияния на неё. Таким образом, это действительно очень захватывающе, поскольку это новая область для микробиологии; популяционная генетика, которая, как может показаться, должна быть хорошо развита в микробиологии, на самом деле таковой не является, так как у нас не было возможности детально изучать генетику природных микробных популяций.

Кроме того, еще одним компонентом подобных исследований является то, что теперь мы можем углубиться в популяционную генетику и популяционную геномику, чтобы буквально наблюдать этот процесс в динамике. Это очень мощный инструмент, который имеет множество практических последствий для нашего понимания того, как микробы приобретают функции и как функции и свойства распространяются по сообществам. Одним из удивительных открытий для нас стало то, что это несколько меняет представление о том, как фенотипические и функциональные свойства могут перемещаться между микроорганизмами. В биологии, разумеется, когда речь идет о половых организмах, мы обычно представляем, что признаки передаются от матери к дочери и так далее.

Таким образом, биологические свойства передаются посредством генетического наследственного механизма. Однако в мире микроорганизмов динамика иная, и мы начинаем видеть это в некоторых метагеномных исследованиях; это связано с так называемым горизонтальным переносом, при котором гены или целые опероны передаются от очень разных организмов путем переноса ДНК. Если эта ДНК экспрессируется в организме-реципиенте и имеет положительную селективную ценность, она может начать распространяться среди многих различных организмов. Недавно, используя методы, которые мы изучаем в лаборатории, мы наблюдали, как это работает: мы получили возможность изолировать очень крупные фрагменты генома из микробных популяций.

Мы проводим эти исследования в разное время и в разных точках пространства. В данном случае нам удалось выделить значительные части геномов вдоль энергетического градиента — градиента света, проникающего в океан. В районах открытого океана, которые мы изучаем, этот градиент выражен очень четко.

Фотическая зона на самом деле довольно глубокая. Она простирается на глубину до 200 метров ниже поверхности моря. При этом энергия, разумеется, меняется как по качеству, так и по количеству.

По мере затухания света с увеличением глубины он становится все более синим, поэтому организмам, обитающим на глубине, доступен лишь более узкий диапазон длин волн. Кроме того, энергия света также снижается. Таким образом, можно начать изучать, как организмы, использующие свет, могут адаптироваться и изменяться в зависимости от функции энергетического градиента, а также разного качества и количества света.

Интересно то, что можно отслеживать конкретные гены и типы микроорганизмов, которые с ними связаны вдоль этих световых градиентов. Если вкратце, мы обнаружили, что некоторые специфические гены, участвующие в сборе световой энергии и называемые родопсинами, настолько легко экспрессируются и требуют столь малого количества генов для создания фотосистемы, что они перемещались между самыми разными видами микробов.

Мы можем утверждать это, поскольку нам удалось выделить фрагменты генома из известных, крайне различных групп, таких как бактерии и археи. И мы обнаруживаем одну и ту же фотосистему с почти идентичными свойствами. Таким образом, можно отслеживать перемещение этих участков функциональных генов между организмами в окружающей среде.

Речь идет не только о картировании генов в организмах, но и об их распределении вдоль градиента окружающей среды. Таким образом, изучая эти крупные фрагменты генома, содержащие фотосистемы, мы замечаем, что они весьма распространены в фотической зоне на глубинах примерно от 0 м до 130 м. Однако при достижении нижней границы фотической зоны и непосредственно под ней эти гены исчезают.

Они исчезают, несмотря на то что те же организмы обитают глубже. И это показывает нам, что в отсутствие селективного давления — то есть в отсутствие света, который позволяет этим генам функционировать — они утрачиваются у самых разных организмов в зависимости от глубины. Это интересно, прежде всего, потому, что дает нам представление об определенном механизме генерации энергии с использованием света: где он встречается в окружающей среде, как распределен между организмами и какая динамика управляет этим процессом.

Но это также интересно в целом как новый способ мышления о том, как картировать гены и геномы не только в организмах, но и в зависимости от того, где эти организмы встречаются в пространстве и времени, где в пространстве и времени находятся эти гены и в чем заключается их пересечение. Мы только начинаем изучать, как это делать. Это был пример всего лишь одного набора генов.

Однако можно задаться общим вопросом: сколько существует категорий таких космополитичных генов, склонных к активному перемещению? Мы не знаем ответа на этот вопрос для конкретной среды обитания, а также того, насколько это распространено и каковы механизмы перемещения этих генов. Является ли это свободной ДНК в окружающей среде? Или же это вирус, распространяющий гены от одного организма к другому?

Все эти аспекты остаются в значительной степени неизвестными, однако теперь к ним можно подойти, используя подобные методы картирования генов в организмах, существующих в природе, сопоставления этих организмов с окружающей средой и анализа их вариативности. Таким образом, наступает новая эра в микробиологии: мы получили возможность наблюдать за динамикой геномов в окружающей среде в режиме «киноленты», и это позволило нам гораздо лучше понять, как на самом деле устроен микробный мир в природе. Разумеется, одной из проблем — как для экологической, так и, я бы сказал, для биомедицинской науки — является сбор всех необходимых типов данных.

В данном случае я имею в виду метаданные, которые, разумеется, представляют собой данные о данных. Если вспомнить приведенный мною пример с океаном, есть ряд параметров, которые необходимо знать. Нужно знать спектральную яркость, величину потока фотонов, длины волн проникающего света, температуру этой воды, соленость и давление, поскольку каждая из этих переменных имеет важное значение для понимания того, как эволюционируют организмы.

Таким образом, помимо получения данных о геномах и организмах, нам необходимо собрать достаточно подробные данные об окружающей среде, которые можно будет сравнить с данными за другие периоды, из других мест или данными других исследователей. И хотя специалисты по экологии давно работают с подобными наборами данных, слияние биоинформатики, геномики и экологической науки произошло сравнительно недавно. Существующие на данный момент базы данных не всегда готовы к приему таких данных.

Можно сказать, что сейчас происходит определенная эволюция как со стороны экологии, так и — поскольку я океанограф и морской биолог — со стороны океанографии, где мы пытаемся наладить взаимодействие со специалистами в области геномики и биоинформатики, и наоборот. Могу привести один пример. Я сотрудничаю с Центром науки и технологий NSF, который называется Центр исследований и образования в области микробной океанографии, или Seymour.

В центре Сеймура мы искренне заинтересованы в том, чтобы запечатлеть всю эту динамику, континуум от геномов до биомов — все эти различные уровни биологической сложности: от генома к транскриптому, протеому, клеткам, популяциям, сообществам и экосистемам. Это огромный объем разнообразной информации. Это довольно амбициозная задача.

Таким образом, этот проект — Центр науки и технологий NSF Seymour — базируется на Гавайях и объединяет группу океанографов, микробиологов и молекулярных биологов, которые стремятся совместно определить способы характеристики конкретной системы подобным образом. В данном случае такой системой является преимущественно верхний слой океана в центральной части Тихого океана. Важной причиной этого является то, что данный подход охватывает огромный биологический компонент, покрывающий две трети нашей планеты. В рамках сотрудничества Seymour взаимодействует с другим проектом, финансируемым фондом Moore, под названием camera.

Проект Camera возглавляют Ларри Смар и Крейг Вентер; его цель — собрать большой объем геномных данных, полученных из окружающей среды, и представить их вместе с синоптическими или экологическими данными. Речь идет об экологических данных, которые собирались одновременно с геномными данными. Таким образом, это совершенно новый подход.

Это только начало, и потребуется больше координации, а также обсуждений стандартов данных и метаданных. И как создать базу данных, способную содержать такую информацию? Поскольку на данный момент основное внимание уделено океану, что задает определенный вектор работы.

Однако можно предположить, что людям, изучающим микробиом человека, определенно потребуются подобные наборы данных в сочетании с клиническими данными, информацией о конкретных людях и так далее. Это совершенно иной круг задач, но во многих аспектах проблема остается той же: сбор геномных данных из природных микробных популяций вместе со всеми связанными и релевантными метаданными о среде их обитания, условиях и прочем. Разумеется, существует надежда на создание крупных реляционных баз данных, которые позволят формулировать достаточно интересные вопросы о конкретных типах или категориях генов.

Можно задуматься о некоторых генах, которые мы обычно связываем с патогенностью, таких как pill I: существуют ли конкретные pill I, которые всегда ассоциируются, скажем, с клинической или патогенной средой, или же эти pill I более распространены и просто адаптированы к определенным обстоятельствам в контексте формирования патогена и так далее. Между этими наборами данных может происходить множество перекрестных связей, которые потенциально помогут понять, как эволюционирует микробиологический мир и как конкретные адаптации могут привести к тому или иному набору экологических взаимоотношений или типов образа жизни. Являюсь ли я свободноживущим?

Являюсь ли я прикрепленным, являюсь ли я патогеном? Все эти вещи взаимосвязаны. Поэтому такие реляционные базы данных по мере своего роста, вероятно, станут очень важными как для практического применения, так и для развития теории.

И, и они еще не достигли этого. Им предстоит пройти долгий путь в течение следующих, о, я бы сказала, пяти или десяти лет. Я думаю, произойдет ряд открытий, конечно, в контексте человеческого генома, а также медицины и генетики человека.

Геном за тысячу долларов стал своего рода «священным граалем», и технологии развиваются довольно быстро, по крайней мере, в области ресеквенирования. Таким образом, одним из главных последствий станет снижение порога доступности получения геномной информации. Под этим я подразумеваю именно экономический аспект.

Это будет гораздо дешевле и значительно быстрее. Вероятно, в недалеком будущем появятся устройства размером с наручные часы, с помощью которых вы сможете секвенировать собственный геном, если захотите. Это определенно находится в сфере возможного.

Когда это произойдет, правила игры немного изменятся. В настоящее время большая часть геномного секвенирования проводится в очень крупных специализированных центрах с большим штатом сотрудников. То, что определенно произойдет с секвенированием генома — и это происходит уже сейчас — заключается в том, что этот процесс станет гораздо более распределенным.

Интересно то, что это создает новые трудности для сбора, стандартизации и распространения данных, так как точечные источники генерации данных становятся все более распределенными. Это представляет собой серьезную проблему, которая, в свою очередь, снова связана с общим вопросом создания баз данных.

Еще одна тенденция, которая начинает проявляться и будет усиливаться, заключается в том, что мы обычно воспринимаем получение геномных данных как процесс, при котором мы вносим информацию в базу данных, она становится частью базы, и на этом всё заканчивается. Однако секвенирование ДНК на самом деле имеет очень мощные области применения в экспериментальной науке. И с появлением новых технологий, выходящих на первый план, я полагаю, мы увидим, что люди будут собирать геномные данные всё чаще в рамках экспериментального подхода, а не просто в режиме сбора и депонирования данных.

Кроме того, можно представить себе отслеживание популяций в окружающей среде путем анализа экспрессии генов, накладывая паттерны экспрессии генов на протеомные паттерны. Все это будет происходить. И поэтому мы, вероятно, будем рассматривать секвенирование генома скорее как экспериментальный инструмент, чем как способ наполнения баз данных.

Таким образом, подобные вещи уже планируются, и, конечно же, центральное место во всем этом будет занимать сбор данных — вычислительная инфраструктура, как аппаратная, так и программная, для обработки всех этих данных, поскольку их объемы колоссальны. Кроме того, речь идет о развитии теории: если рассматривать биологическую теорию, в частности применительно к экологии, то большая ее часть основана на изучении крупных организмов, крупных половополых организмов, и фактически некоторые «правила игры» и некоторые положения теории не обязательно применимы к миру микробов. Поэтому я считаю, что для математиков и теоретиков в будущем открываются огромные возможности по использованию данных, которые собираются сейчас и будут собираться в дальнейшем, в качестве своего рода моделей данных для разработки новой и прогностической теории.

В конечном итоге всё сводится к пониманию того, как работает наша планета, отчасти потому, что воздух, которым мы дышим, а также потоки вещества и энергии, которые обеспечивают баланс элементарных циклов на Земле, в значительной степени регулируются совокупной деятельностью микробных видов. Поскольку мы, как вид, в настоящее время оказываем столь же сильное воздействие на некоторые циклы энергии и вещества — взять, к примеру, CO2 в атмосфере, — становится всё более важным понимать динамику и детали того, как поддерживается природный баланс, который мы нарушаем, и начать задумываться о способах того, как мы могли бы жить в большей гармонии с циклами вещества и энергии на нашей планете. Поэтому я полагаю, что часть этой фундаментальной науки, которая кажется редукционистской, в конечном итоге, благодаря метагеномике, некоторым другим упомянутым мною методам и теории, эволюционирует в более целостную науку в плане понимания сложных систем — не только на уровне клетки, но и на уровне всей нашей планеты.

Таким образом, используя некоторые из тех методов, которые мы продемонстрировали вам в лаборатории, и учитывая текущее состояние данной области, мы сейчас делаем лишь первые шаги. Однако, думаю, мы уже можем увидеть определенные намеки на то, в каком направлении может развиваться эта область. Будет очень интересно, если нам удастся понять, как организовать этот процесс, поскольку для объединения всех аспектов потребуются навыки широкого круга специалистов: технологов, теоретиков, математиков и инженеров.

Итак, сейчас наступили интересные времена, и на данном этапе они определенно станут еще более захватывающими.