Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 4:47 мин. • April 30th, 2023
- Кардиомиопатия – состояние, при котором сердечная мышца ослабевает и теряет способность перекачивать кровь. Это состояние может быть воспроизведено у рыбок данио. Во-первых, разведите стоковый раствор препарата, отвечающего за кардиотоксичность, в сбалансированном солевом растворе Хэнкса для приготовления нескольких рабочих концентраций. Далее поместите рыбу под наркозом под трикаином брюшной стороной вверх на удерживающую губку под препарирующим микроскопом. Расположите иглу между брюшными плавниками под углом 45 градусов от горизонтали.
Теперь аккуратно протолкните иглу на 1 – 2 миллиметра в брюшную полость и медленно введите раствор препарата. Подождите пять секунд, прежде чем вытаскивать иглу, чтобы раствор не вытек. Сразу же пересадите рыбок в чистый аквариум с пресной водой из системы. Записывайте количество рыб, погибающих каждый день из-за сильной кардиотоксичности, повреждения сердечной мышцы. Препарат связывается с рецепторами смерти, присутствующими на клеточной мембране кардиомиоцитов, и вызывает апоптоз, что приводит к тяжелой кардиотоксичности.
Создайте кривую выживаемости, график, отображающий вероятность выживания с течением времени для каждой концентрации препарата. В этом примере мы будем вводить доксорубицин, или DOX, чтобы вызвать кардиомиопатию у взрослой рыбки данио-рерио двумя способами.
Перед введением рыбе DOX, голодайте в течение 24 часов. Далее сгруппируйте рыбу. Под наркозом используйте чистую фильтровальную бумагу, чтобы высушить каждую рыбу и измерить ее массу тела. Составляйте группы рыб, которые находятся в пределах 10% от одной и той же массы тела, чтобы каждой группе можно было вводить одинаковую дозу DOX. Далее рассчитайте рабочую концентрацию DOX для каждой группы так, чтобы каждой группе вводили пять микролитров раствора и получали одинаковую дозу DOX по массе тела.
Затем разбавьте запас DOX в 1x HBSS. Смешайте разбавляемое вещество с вихревым механизмом, а затем импульсно вращайте разбавление, чтобы оно слиплось в пробирке. Для инъекции подготовьте платформу для инъекций. В чистую 100-миллиметровую чашку Петри поместите губку. С помощью диссекционного микроскопа вырежьте полость в губке, чтобы вместить одну рыбку, четыре сантиметра обычно получается.
Затем к игле 34 калибра прикрепите микрошприц объемом 10 микролитров. Затем промойте иглу 1x HBSS, чтобы удалить любые пузырьки или блоки из шприца и трубки. Теперь кратковременно обезболите взрослых рыб трикаином. Затем замочите губку в зародышевой воде с трикаином и переложите рыбу на губку брюшком вверх для инъекции. Теперь внутрибрюшинно введите раствор DOX, быстро введя иглу под углом 45 градусов в среднюю линию между брюшными плавниками глубиной от 1 до 2 миллиметров.
Затем медленно выпустите весь раствор DOX. Прежде чем втянуть иглу, подождите пять секунд. В качестве альтернативы, рыбу можно расположить сбоку с внутренней стороной вправо. Затем вводится боковая линия над брюшным плавником скосом вверх, направленная в сторону 7 часов под углом 45 градусов и глубиной от 3 до 4 миллиметров. Если какой-либо из методов инъекции оказался успешным, в области живота будет красный оттенок.
После инъекции быстро пересадите рыбу в чистый резервуар, наполненный пресной водой, где она сможет восстановиться. Затем промойте иглу с помощью HBSS и приступайте к введению следующей рыбы. Позже введенную рыбу верните в систему с работающей циркуляцией, но отдельно от основной системы, чтобы избежать перекрестного загрязнения. В течение следующих 24 часов продолжайте голодать рыбу. В течение первой недели, после инъекции, обязательно проверяйте рыбу ежедневно и удаляйте любую мертвую рыбу.