Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Общая цель данной процедуры — подготовка тканей головного мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии. Это достигается путем первоначальной фиксации мозга посредством перфузии животного. Вторым этапом процедуры является разрезание мозга и обработка срезов для иммуногистохимического анализа.

Третьим этапом процедуры являются фиксация, дегидратация и заливка срезов. Заключительным этапом процедуры является изготовление ультратонких срезов. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие с высоким пространственным разрешением распределение различных белков в разных областях и типах клеток центральной нервной системы.

Здравствуйте, я Мария Тромбли из лаборатории Эски на кафедре нейробиологии и анатомии Рочестерского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру подготовки тканей головного мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения взаимодействий между микроглией и синапсами в процессе развития, при опыта-зависимой пластичности и старении.

Итак, приступим. После фиксации мозга мыши путем интракардиальной перфузии проведите дофиксацию в приблизительно 10 миллилитрах формальдегида при температуре 4 °C в течение двух часов. Промойте мозг в 1X PBS при 4 °C трижды по 10 минут за каждую промывку, используя вибратор и ледяной 1X PBS, после чего немедленно нарежьте мозг на поперечные срезы толщиной 50 микрон.

С помощью тонкой кисти перенесите выбранные срезы в стеклянный флакон, заполненный 1x PBS при температуре 4 °C. Остальные срезы храните в криопротекторе при температуре -20 °C до нескольких лет без изменения их свойств. В каждом стеклянном флаконе обрабатывайте для окрашивания не более 10 свободно плавающих срезов.

С помощью переносной пипетки замените 1X PBS свежим 0,1% раствором борогидрида натрия в PBS; смену растворов следует проводить быстро, чтобы срезы не пересохли. Инкубируйте в течение 30 минут, затем промойте срезы 1X PBS трижды по 10 минут каждый раз. Тщательно удаляя все пузырьки воздуха, заблокируйте срезы в 1X PBS, содержащем 0,5% желатина и 5% нормальной сыворотки, соответствующей используемым вторичным антителам.

Инкубируйте в течение двух часов. Добавьте первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе. Инкубируйте в течение 48 часов.

Промойте один раз 1X PBS трижды по 10 минут. Затем инкубируйте с вторичными антителами, конъюгированными с биотином и разведенными в блокирующем растворе, в течение двух часов. Промойте трижды по 10 минут в 1X PBS, как указано выше.

Инкубируйте срезы в течение одного часа со стрептавидином-пероксидазой хрена, разведенным в блокирующем растворе. Промойте срезы один раз в 1X PBS и дважды в 1X TBS по 10 минут каждый раз. Для визуализации метки инкубируйте срезы со свежеприготовленным раствором, содержащим 0,05% DAB и 0,01% перекиси водорода в 1X TBS.

Когда окрашивание станет заметно темно-коричневым или когда реакция продлится пять минут, промойте срезы одним XTBS, чтобы остановить реакцию. Затем промойте один раз одним XTBS и дважды одним x PB по 10 минут каждый раз. В вытяжном шкафу с помощью тонкой кисти перенесите срезы в многолуночный культуральный планшет, заполненный одним XPB.

Аккуратно удалите PB из одной лунки с помощью тонкой кисти, чтобы срезы сразу легли ровно. Перед переходом к следующей лунке добавьте раствор 1% тетраоксида осмия в 1x PB, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите срезы с OSM в стеклянные флаконы.

Промойте один раз в XPB трижды по 10 минут. Обезводьте срезы в растворах этанола возрастающей концентрации. Затем обработайте пропиленоксидом, как описано в текстовой части данного протокола.

Используйте тонкую кисть, промытую в пропиленoxide, чтобы перенести срезы в свежеприготовленную смолу dupant. Для пропитки в течение ночи поместите чашку со срезами в печь при температуре 55 °C на 10 минут. Чтобы размягчить смолу, используйте кисть, промытую в пропиленoxide, чтобы нанести на хлорированную пленку для заливки тонкий слой смолы.

Перенесите срез на пленку и накройте его другим слоем вментирующей пленки. Равномерно распределите сверху небольшие грузики массой около 2 г, чтобы помочь смоле растечься. Поместите образец в инкубатор для полимеризации смолы при температуре 55 °C на период от 48 до 72 часов. После завершения полимеризации снимите грузики и верхний слой вментирующей пленки под бинокулярным микроскопом.

Выберите участки интереса размером два на два миллиметра и с помощью лезвия бритвы вырежьте их из пленки. Приклейте выбранные участки к наконечникам полимерных блоков с помощью суперклея. Выдержите в инкубаторе при температуре 55 °C в течение одного часа.

С помощью лезвия бритвы обрежьте блок смолы до формы равнобедренной трапеции, которая является оптимальной для сверхтонкого всасывания. Используя микротом и стеклянный нож, удалите слой клея с поверхности ткани, чтобы получить плоскую поверхность для всасывания.

Наполните кювету стеклянного микротома дважды дистиллированной водой и сделайте несколько срезов толщиной от 0,5 до 1 мкм. Используя PerfectLoop, перенесите срезы на предметное стекло SuperFrost. Высушите на нагревательной платформе при 80 °C в течение одной минуты, затем окрасьте 0,1% раствором толуидинового синего в течение одной минуты.

Используйте пульверизатор, чтобы удалить излишки красителя дважды дистиллированной водой. Под световым микроскопом исследуйте срезы, чтобы отличить окрашенную ткань от смолы. Делайте полутонкие срезы до тех пор, пока граница между тканью и смолой не окажется примерно посередине среза. Замените стеклянный нож алмазным и наполните лодочку дважды дистиллированной водой.

Вырежьте ультратонкие срезы серебра. Толщина срезов должна составлять от 60 до 80 nanometers. С помощью тонкого инвертированного пинцета аккуратно перенесите срезы на медные сетки.

Высушите сетки на фильтровальной бумаге для повышения контрастности. С помощью тонкого инвертированного пинцета перенесите сетку в каплю цитрата свинца на две минуты. Аккуратно промойте сетку, последовательно погружая ее в три ванночки с дважды дистиллированной водой.

Просушите сетку на фильтровальной бумаге и поместите ее в контейнер для сеток для последующего исследования с помощью электронного микроскопа. Исследуйте сетки под электронным микроскопом для визуализации иммуноокрашивания, а также морфологии клеточных элементов, их внутриклеточных органелл и взаимосвязей между ними.

Здесь представлено репрезентативное иммуноокрашивание на IBA1 при световой микроскопии. Клеточное распределение IBA1 ограничено микроглией, что подтверждает его специфичность на электронно-микроскопическом уровне. Видны иммуноокрашенные перикарионы и отростки микроглии, окрашенные на IBA1.

Иммунопероксидазное окрашивание DAB проявляется в виде электронно-плотного осадка. На других примерах иммуноокрашенных микроглиальных отростков IBA1 видны различные размеры и формы. Большее увеличение позволяет увидеть различные внутриклеточные органеллы внутри одного из микроглиальных отростков, а также ультраструктурные взаимосвязи между другим микроглиальным отростком и соседними элементами нейропиля, включая синапсы.

Мы только что продемонстрировали вам способ подготовки тканей мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии. При выполнении этой процедуры важно строго соблюдать все этапы и бережно обращаться с тканями мозга. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.