Генерация первичных маммосфер: методика определения активности клеток

Одна стволовая клетка рака молочной железы дает начало кластеру клеток, называемому первичной маммосферой. Чтобы получить их, сначала культивируйте клеточную линию рака молочной железы до 70-80% конфлификации, чтобы убедиться, что клетки находятся в фазе роста. Добавьте Трипсин-ЭДТА, чтобы отделить клетки от колбы, и добавьте среду с сывороткой, чтобы остановить действие Трипсина.

Теперь возьмите клетки в пробирку и центрифугируйте для получения клеточной гранулы. Повторно суспендируйте гранулу в маммосферной среде без сыворотки и пропустите суспензию через фильтр крышки сетчатого фильтра, чтобы получить одноклеточную суспензию. Эта суспензия состоит из стволовых клеток, клеток-предшественников и дифференцированных клеток, демонстрирующих различную экспрессию белков.

CD44 и CD24 представляют собой белки клеточной поверхности, характерные для стволовых клеток рака молочной железы. Они положительны на экспрессию CD44 и отрицательны на CD24. Выделите клетки из клеточной суспензии с помощью флуоресцентной или магнитно-активированной сортировки клеток. Затем возьмите аликвоту и трипановый синий краситель на клетки и рассчитайте количество жизнеспособных клеток на миллилитр с помощью пре