Трансдукция для мечения опухолевых клеток PDX: введение лентивируса, экспрессирующего флуоресцентный маркер, в опухолевую клетку in vitro

Лентивирус — это ретровирус, который содержит генетический материал РНК. Этот вирус обеспечивает эффективный и стабильный метод введения трансгенов в линии раковых клеток. Начните с добавления нейраминидазы в пробирку, содержащую лентивирус, который экспрессирует зеленый флуоресцентный белок, или GFP. Держите пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы повысить эффективность связывания вируса.

Затем центрифугируйте пробирку, содержащую суспензию опухолевых клеток, чтобы получить гранулу. Добавьте маммосферную среду, содержащую полибрен, для ресуспендирования клеток. Полибрен – катионный полимер, повышающий эффективность лентивирусной инфекции. Теперь нанесите в планшет оптимальное количество опухолевых клеток на лунку в шестилуночном планшете для культуры тканей. Добавьте необходимое количество Лентивируса в каждую лунку культуральной пластины.

Перемешайте содержимое пластины и держите при температуре 37 градусов Цельсия в течение 96 часов с непрерывной подачей углекислого газа. Лентивирус проникает в клетку и высвобождает РНК. Вирусная обратная транскриптаза преобразует РНК в двухцепочечную ДНК, которая интегрируется в геном хозяина. Поместите пластину под флуоресцентный микроскоп и следите за клетками для успешной трансдукции. Трансдуцированные клетки флуоресцируют за счет экспрессии GFP.

В примере протокола мы будем проводить трансдукцию PDX-диссоциированных опухолевых клеток лентивирусными векторами.

Для трансдукции опухолевых клеток выделенные клетки центрифугируют для ресуспензии в двух миллилитрах маммосферной среды. После подсчета снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах маммосферной среды, дополненной 20 микролитрами полибрена. Затем нанесите в планшет 2 раза по 10 до пятой жизнеспособных опухолевых клеток на лунку в шестилуночном планшете для культивирования тканей и частицы лентивируса в клетки при кратности инфекции 10.

Поворачивайте планшет, чтобы смешать вирус с клетками, и инкубируйте сокультуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 96 часов, добавляя 500 микролитров свежей маммосферной среды после первых 24 часов. Когда по крайней мере 10% клеток будут GFP-положительными, перенесите трансдуцированные клетки хотя бы из одной лунки в коническую трубку объемом 15 миллилитров на льду и промойте лунку одним миллилитром маммосферной среды.

Объедините промывку с клетками и центрифугируйте опухолевые клетки в 10 миллилитрах HBSS плюс HEPES. Наконец, ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах экстракта базальной матрицы на льду и загрузите внедренные клетки в инсулиновый шприц объемом 0,5 миллилитра для реимплантации.