Органная кондиционированная среда: генерация среды из собранных клеток органов для исследований метастатического рака

Некоторые органы вырабатывают растворимые факторы и становятся предпочтительными местами для метастазирования рака молочной железы. Кондиционированная среда, приготовленная из этих собранных органов, может помочь идентифицировать и изучить такие факторы.

Начните с помещения собранного органа, такого как печень, в пробирку с холодным PBS и переворачивайте трубку вверх и вниз, чтобы удалить остаточную кровь органа. Поместите орган в чашку Петри. И с помощью скальпеля нарезать орган кубиками на мелкие кусочки.

Ресуспендируйте эти кусочки в пробирку, содержащую базальную среду с добавлением антибиотика для поддержки роста клеток и предотвращения загрязнения. Теперь вылейте клеточную суспензию в культуральную пластину и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывной подачей углекислого газа в течение необходимого времени.

Во время инкубации эти клетки выделяют в среду метаболиты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса. Далее переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и добавьте свежую среду для ее разбавления. Центрифугируйте пробирку и отфильтруйте надосадочную жидкость, которая является кондиционированной средой, в свежую пробирку.

В следующем протоколе мы подготовим кондиционированную среду из легких и мозга мыши для изучения метастатического поведения клеток рака молочной железы.

Чтобы получить легочную кондиционированную среду, трижды переверните трубки легочной ткани, чтобы удалить остатки крови из органов. Затем замените полоскание на свежее холодное PBS и повторяйте до тех пор, пока солевой раствор не станет бескровным.

Затем перенесите легкие в одну стеклянную чашку Петри площадью 60 квадратных миллиметров для каждой мыши и используйте два стерильных лезвия скальпеля, чтобы измельчить ткани с повторяющимся нарезыванием вперед и назад.

Когда фрагменты ткани достигнут размера примерно 1 миллиметр в кубе, ресуспендируйте кусочки в соответствующем объеме среды DMEM/F-12 с добавлением антибиотиков и инкубируйте ткани в одной лунке 6-луночного планшета на каждую мышь при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Через 24 часа перелейте все содержимое каждой лунки в отдельные 50-миллилитровые конические пробирки и разбавьте кондиционированную среду тремя эквивалентными объемами свежей среды DMEM/F-12 на пробирку.

Центрифугируйте пробирки, чтобы удалить крупные куски остатков тканей. Затем объедините кондиционированную среду через ситечко шприца 0,22 микрона в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров.