Механическая диссоциация: метод получения жизнеспособных клеток из ткани

Сначала взвесьте фрагмент ткани и измерьте его длину, ширину и высоту. Поместите ткань в чашку для культуры с питательной средой и нарежьте ее на мелкие кусочки с помощью скальпеля. Переложите все в С-образную трубку для гомогенизации с помощью пастеровской пипетки.

Поместите трубку в механический диссоциатор и выполняйте циклы по мере необходимости. Аппарат использует механические силы для извлечения жизнеспособных одиночных клеток из образца ткани, сохраняя при этом клеточную целостность, включая поверхностные белки. Сцедите гомогенат через сетчатое фильтр, закрепленное на трубке центрифуги.

Повторно гомогенизируйте оставшуюся ткань и процедите гомогенат через клеточный фильтр в трубку. Центрифугируйте гомогенат и удалите надосадочную жидкость. Теперь повторно суспендируйте клеточную гранулу в питательной среде и перенесите небольшое количество клеточной суспензии в пробирку, содержащую трипановый синий краситель.

После окрашивания перенесите клетки на предметное стекло гемоцитометра. Посчитайте прозрачные жизнеспособные клетки. Мертвые клетки впитывают пятно, так как их клеточная мембрана не повреждена. В следующем протоколе мы проведем неферментативную диссоциацию свежей ткани человека для количественного и качественного анализа CD45+ клеток.

- Начните с взвешивания образца ткани, а затем измерьте длину, ширину и высоту ткани. Затем перенесите фрагмент ткани в небольшую чашку Петри, содержащую 1 миллилитр соответствующей химически определенной, не содержащей сыворотки крови, клеточной среды и с помощью стерильного скальпеля нарежьте образцы небольшими кусочками размером от 1 до 2 квадратных миллиметров. Далее переложите содержимое посуды в механический диссоциатор С-образной трубки и промойте посуду и скальпелем 2 миллилитрами среды.

Добавьте смывку в С-образную трубку, а затем запустите программу механического диссоциатора 8.01 два раза подряд, чтобы мягко гомогенизировать фрагменты ткани в одноклеточную суспензию. После второго цикла сцедите гомогенат через 40-микрометровое клеточное ситечко в 50-миллилитровую коническую пробирку. Затем используйте ту же пипетку Пастера от мытья чашки Петри, чтобы перенести оставшуюся в С-образной трубке жидкость в сетчатое фильтр.

Далее с помощью 1-миллилитровой микропипетки переложите отфильтрованную жидкость в 15-миллилитровую коническую пробирку и промойте С-образную трубку дополнительными 3 миллилитрами среды. Перелейте эту промывку через сетчатое фильтр в 50-миллилитровую трубку. Затем аккуратно переместите негомогенизированную ткань вокруг ситечка чистым наконечником объемом 1 миллилитров, чтобы выдавить максимальное количество остаточной жидкости, попавшей в ткань, в 50-миллилитровую трубку. Теперь поместите клеточный фильтр вверх дном поверх исходной С-образной трубки и промойте его еще 3 миллилитрами среды, чтобы негомогенизированная ткань упала обратно в С-образную трубку.

Повторно гомогенизируйте ткань еще на два цикла, как только что было показано, а затем снова влейте второй гомогенат через клеточный фильтр. Промойте С-образную трубку еще 3 миллилитрами среды. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через ситечко и выдавите остаточную жидкость из ткани, как только что продемонстрировано. К этому моменту в 15-миллилитровой пробирке должен присутствовать объем примерно 2,5 миллилитров одноклеточной суспензии, а в 50-миллилитровой пробирке должно наблюдаться примерно 9 миллилитров.

Чтобы отделить надосадочную жидкость тканей от клеток, сначала центрифугируйте обе пробирки с гомогенатом в течение 15 минут при 600 G при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость из 15-миллилитровой трубки в 1,5-миллилитровую трубку, поместив ее при температуре 4 градуса Цельсия, и выбросьте надосадочную жидкость из 50-миллилитровой трубки. Затем осторожно постучите каждой трубкой по твердой поверхности, чтобы разбить каждую из гранул клетки.

Ресуспендируйте гранулу со свободными ячейками в 50-миллилитровой пробирке с 500 микролитрами среды и перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку для ресуспендирования второй гранулы. Затем промойте 50-миллилитровую пробирку еще 500 микролитрами среды и переложите промывку в 15-миллилитровую пробирку для максимального восстановления клеток. Подсчитав количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего, гранулируйте клеточную суспензию.

Наконец, уменьшите остатки надосадочной жидкости. Затем осторожно перенесите надосадочную жидкость по крайней мере в одну чистую пробирку, не касаясь и не тревожа гранулу, и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего анализа.