Анализ образования колоний мягких агаров: метод проверки влияния новых соединений на пролиферацию раковых клеток

Для начала возьмите соответствующую концентрацию расплавленной агарозы в конической трубке и добавьте в нее нужное количество теплой питательной среды. Аккуратно переверните, чтобы перемешать содержимое. Добавьте эту смесь в каждую лунку шестилуночной пластины и дайте ей застыть. Это нижний слой. Далее обработайте раковые клетки интересующим соединением и добавьте необходимую концентрацию агарозы.

Теперь вылейте эту смесь, содержащую нужное количество клеток на миллилитр, в каждую лунку. Это слой, содержащий клетки. Как только среда застынет, инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение недели. Приготовьте питательный слой, смешав агарозу со средой и дополните эту смесь интересующим составом. Аккуратно добавьте этот питательный слой в каждую лунку, дайте ему застыть и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия.

Повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, чтобы пополнить клетки средой до образования колоний. Если исследуемое соединение является ингибитором онкогенности, оно будет подавлять рост клеток, что приведет к небольшому количеству колоний в лунках. В следующем протоколе мы проведем анализ образования колоний мягкого агара для изучения влияния ингибиторов PADI на онкогенность клеток рака молочной железы.

Начните эту процедуру с приготовления 3% 2-гидроксиэтилагарозы. В чистую сухую стеклянную бутылку объемом 100 миллилитров добавьте 0,9 грамма 2-гидроксиэтилагарозы, а затем 30 миллилитров дистиллированной воды. Разогрейте смесь в микроволновой печи в течение 15 секунд и аккуратно взболтайте. Повторяйте этот шаг до полного растворения агарозного порошка. Далее автоклавируйте раствор, содержащий флакон в течение 15 минут.

Перед дальнейшим использованием дайте агарозному раствору остыть до комнатной температуры. Предварительно подогрейте несколько пипеток объемом пять миллилитров и 10 миллилитров в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетке при работе. Частично ослабьте крышку бутылки и разогрейте в микроволновой печи готовый 3% раствор 2-гидроксиэтилагарозы в течение 15 секунд. Затем аккуратно взболтайте раствор и поставьте в микроволновую печь еще на 15 секунд.

Будьте осторожны при взмешивании раствора агарозы, потому что при контакте с воздухом раствор поднимается вверх и может разлиться. Если во флаконе остались остатки твердого геля, поставьте в микроволновую печь еще на несколько секунд. Держите флакон с раствором агарозы на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия во время следующих действий, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание раствора агарозы.

Далее переложите 12 миллилитров подогретых сред с помощью предварительно подогретых пипеток в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Сразу же добавьте три миллилитра 3% раствора агарозы и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы перемешать агарозу со средой. Затем аккуратно добавьте по два миллилитра этой смеси в каждую лунку шестилуночного планшета, не образуя пузырьков воздуха. Инкубируйте шестилуночную культуральную пластину горизонтально на плоской поверхности при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа, чтобы смесь затвердела.

После того как смесь застынет, поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут. Теперь нижний слой готов к использованию.

Сложным аспектом этой процедуры является обеспечение того, чтобы все клетки были распределены равномерно и что расплавленный агарозный гель не затвердел перед добавлением в каждую лунку, чтобы убедиться, что клетки смешиваются в среде перед добавлением жидкого агарозного геля. Кроме того, пипетки предварительно нагреваются, чтобы избежать застывания растворов во время работы.

Чтобы получить слой, содержащий клетки, сначала трипсинизируйте MCF10DCIS клетки и разбавьте их до клеточной концентрации 40 000 клеток на миллилитр. Затем возьмите восемь миллилитров среды с помощью предварительно подогретых пипеток, и переложите в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Сразу же добавьте в коническую трубку два миллилитра 3% агарозы, и аккуратно переверните для смешивания агарозы с фильтрующим материалом. Избегайте образования пузырей.

Затем возьмите два миллилитра клеток и обработайте их двумя микромолярными BB-хлорамидином в ДМСО, или только ДМСО в качестве контроля. После обработки смешайте клетки с 0,6% агарозой в соотношении один к одному, чтобы получить концентрацию одного микромолярного BB-хлорамидина. Затем возьмите один миллилитр клеточно-агарозной смеси и аккуратно добавьте на нижний слой шестилуночной культуральной пластины.

Поместите шестилуночную культуральную пластину горизонтально на плоскую поверхность при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на 15 минут, чтобы дать верхнему слою застыть. После того как смесь застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на неделю перед добавлением слоя кормления. Начните подготовку подающего слоя, разогрев в микроволновой печи предварительно приготовленный 3% 2-гидроксиэтилагарозный раствор, как и раньше, и уравновесив флакон с агарозным раствором на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия.

Смешайте один миллилитр 3% раствора агарозы с девятью миллилитрами теплой среды в 50-миллилитровую коническую трубку, и аккуратно переверните, чтобы перемешать агарозу со средой. Избегайте образования пузырьков воздуха. После обработки смеси ВВ-хлор-амидином аккуратно добавьте по одному миллилитру смеси в каждую лунку шестилуночной питательной пластины, содержащей нижний и мягкий слои. Затем поместите шестилуночную культуральную тарелку горизонтально на плоскую поверхность при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на 15 минут, чтобы смесь затвердела.

После того как слой питателя застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, нанося один миллилитр 0,3% раствора для обработки агарозной среды на существующий питательный слой для пополнения клеток новыми средами до тех пор, пока не будет наблюдаться образование колоний.