Агарозное раздувание всего легкого: метод подготовки легких к визуализации ex vivo в реальном времени

- Сначала поместите усыпленную мышь на доску для вскрытия. Прямо над животом прорежьте кожу и брюшину. Проколите диафрагму и разрежьте вдоль ребер и грудной клетки до трахеи. Сделайте небольшой разрез в трахее. Аккуратно введите иглу внутрь трахеи, не травмируя киль, и закрепите ее щипцами. Ввести в легкие агарозу с низкой температурой плавления при нормальной температуре тела. Медленно извлеките шприц и держите иглу внутри, чтобы предотвратить обратный поток агарозы.

Вылейте холодный PBS на легкие, чтобы способствовать образованию агарозного желирования. Извлеките иглу и закрепите трахею щипцами, чтобы избежать обратного тока незастывшей агарозы. Разрежьте грудину, зажмите трахею щипцами, разрежьте ее ножницами. Вытащите легкие из грудной полости. Отделите доли в среде. Поместите внутрь лунки для визуализации в физиологических условиях для микроскопии. Агароза сохраняет морфологию легких при физиологических температурах, что помогает наблюдать за живыми клеточными взаимодействиями. В следующем протоколе мы продемонстрируем визуализацию легких ex vivo для изучения взаимодействия между раковыми клетками и стромальными клетками.

- Чтобы подготовить легкие к визуализации ex vivo в реальном времени, начните с иммобилизации мыши на крышке из пенополистирола, накрытой куском замачивания, и простерилизуйте животное с помощью 70% этанола. Далее с помощью хирургических ножниц делают поперечный надрез через кожу, с последующим аналогичным разрезом через брюшину. Затем, переместив доску для вскрытия в вертикальное положение, разрежьте нисходящую аорту так, чтобы кровь стекала в брюшную полость, а не в грудную полость.

Отрежьте небольшое отверстие в диафрагме, чтобы выпустить вакуум, затем разрежьте вдоль грудной клетки, чтобы иссечь диафрагму и визуализировать легкие. С помощью хирургических ножниц разрежьте кожу до трахеи над грудной клеткой, оставив ребра нетронутыми. Затем отделите кожу от грудной клетки и удалите окружающую соединительную ткань, чтобы обнажить трахею, стараясь не повредить саму трахею. Отрежьте небольшое отверстие диаметром примерно 1 миллиметр в открытой трахее параллельно хрящевым кольцам как можно ближе к гортани, не разрезая трахею полностью.

Затем аккуратно введите иглу 20 калибра на 4-5 миллиметров в трахею без какого-либо противодействия. Конец иглы должен быть виден через трахею. Наполните шприц 400 микролитрами 37 градусов Цельсия 2% низкой температурой плавления агарозой, а затем стабилизируйте иглу щипцами. Держа доску для вскрытия в вертикальном положении, медленно закапывайте все количество теплой агарозы через иглу в легкие. После того, как легкие надутся, отсоедините шприц, держа иглу внутри трахеи, и налейте примерно 50 миллилитров 20 градусов Цельсия PBS на легкие, чтобы помочь закрепить агарозу.

Когда агароза затвердеет, удалите иглу и с помощью щипцов закройте трахею, чтобы предотвратить утечку любой незатвердевшей агарозы. Теперь вскройте грудную клетку дальше с помощью стернотомии и обхватите трахею щипцами. Затем с помощью хирургических ножниц разрежьте трахею полностью. Чтобы удалить легкие, аккуратно потяните трахею вверх, отрежьте соединительную ткань и пищевод, а также полностью вытяните легкие из грудной полости.

Погрузите салфетку в температуру 37 градусов Цельсия RPMI 1640, чтобы смыть излишки крови. С помощью ножниц и щипцов разрежьте главный ствол бронхов долей у ворот и аккуратно отделите доли легких. Перенесите доли в одну лунку 24-луночного визуализирующего планшета плоской поверхностью вниз и покройте ткань 100 микролитрами 37 градусов Цельсия RPMI 1640. Поместите несколько 15-миллилитровых предметных стекол круглого микроскопа поверх лепестков, чтобы они не всплывали, и налейте теплый PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение среды. Затем вставьте 24-луночный планшет в климатическую камеру, а затем перенесите камеру на столик конфокального микроскопа.