3-мерная культура клеток карциномы легкого: метод изучения клеточно-матриксных взаимодействий
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:45 мин • April 30th, 2023
- Сначала разморозьте флаконы матрицы базальной мембраны при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. Матрикс базальной мембраны состоит из белков, присутствующих в микроокружении опухоли, которые помогают поддерживать характеристики раковых клеток in vitro. На следующий день поместите флакон с базальной мембраной на лед, чтобы сохранить матрицу в жидком состоянии. Возьмите клетки рака легких в предварительно охлажденную центрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость и легкими постукивающими движениями, чтобы выбить гранулу и положить ее на лед. Далее добавьте в эту пробирку соответствующий объем смеси базальной мембраны и перемешайте, чтобы получилась равномерная клеточная суспензия. Выполняйте все действия при низкой температуре, чтобы предотвратить образование базальной мембраны.
Перенесите соответствующий объем суспензии ячеистой матрицы в центр каждой лунки в предварительно охлаждаемую луночную пластину, охватывающую всю лунку. Инкубируйте луночную пластину, чтобы матрица застыла. Исследуйте под микроскопом, чтобы убедиться в равномерном распределении клеток внутри матрицы. Добавьте в каждую лунку готовую среду для 3D-культуры и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. Эта среда облегчает взаимодействие клеточного матрикса. Таким образом, клетки образуют органоиды с ацинароподобными структурами. В соответствии с приведенным ниже протоколом мы выполним 3D-культивирование клеток карциномы легкого TUM622.
Для начала разморозьте флаконы матрицы базальной мембраны в холодильнике с температурой 4 градуса Цельсия на ночь. Охладите две миллилитровые пластиковые пипетки и наконечники при температуре минус 20 градусов Цельсия на ночь. На следующий день нагрейте реагенты, используемые для диссоциации клеток TUM622, буфер HEPES, Trypsin-EDTA и буфер для нейтрализации трипсина, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Достаньте размороженную матрицу базальной мембраны из холодильника и положите флакон на лед. Охладите планшеты для культивирования тканей на металлической платформе-холодильнике, помещенном на лед. Поместите пробирки центрифуги на металлическую решетку для охлаждения на льду. Рассчитайте количество необходимых ячеек, исходя из количества лунок и концентрации ячеек в каждой лунке, которые необходимо подготовить. Перенесите суспензию ячеек TUM622 в охлаждаемую центрифужную пробирку и вращайте со скоростью 300 g в подвешенном ведре при температуре 4 градуса Цельсия в течение пяти минут.
С помощью аспирационной пипетки, прикрепленной к нефильтрованному наконечнику, осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно 100 микролитров среды. Осторожно постучите по боковой стороне трубки, чтобы выбить и связать гранулу, а затем верните ее на решетку для охлаждения. Используя два миллилитра предварительно охлажденных пипеток, аккуратно перемешайте матрицу на льду, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Пипетку следует проводить с равномерной и умеренной скоростью, чтобы во время этой процедуры в матрицу не вводились пузырьки.
Перелейте по 1,1 миллилитра матрицы в каждую центрифужную пробирку. Используя предварительно охлажденные наконечники, пипетируйте матрицу в каждой пробирке вверх и вниз около 10 раз, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Перелейте по 310 микролитров клеточно-матричной суспензии в каждую лунку предварительно охлажденного 24-луночного планшета. Поместите пипетку под углом 90 градусов к поверхности пластины и добавьте суспензию к центру лунки. Суспензия распространяется и покрывает весь колодец. Чтобы облегчить последующий иммунофлуоресцентный анализ, перенесите 60 микролитров суспензии клеточного матрикса в центр лунки предметного стекла с 2-луночной камерой. Это позволяет матрице образовывать куполообразную структуру с гораздо меньшим объемом.
Верните планшет и камеру, вставьте обратно в инкубатор для культуры тканей и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы матрица затвердела. После этого осмотрите пластину и проведите под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отдельные клетки равномерно распределены внутри матрицы. Добавьте 1 миллилитр предварительно подогретой 3D питательной среды в каждую лунку планшета и 1,5 миллилитра 3D питательной среды в каждую лунку предметного стекла камеры. Затем верните их в инкубатор.
Обзор
В данной статье представлен протокол трехмерного (3D) культивирования клеток карциномы легкого линии TUM622 с использованием матрикса базальной мембраны. В методе особое внимание уделяется поддержанию низких температур во время подготовки, чтобы предотвратить гелеобразование матрикса.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Культивирование клеток
- Биология рака
- 3D-тканевая инженерия
Теоретическая часть
- Матрикс базальной мембраны имеет решающее значение для сохранения характеристик раковых клеток in vitro.
- 3D-культуры могут лучше имитировать микроокружение опухоли по сравнению с традиционными 2D-культурами.
- Органоидные структуры, сформированные в 3D-культурах, могут дать представление о биологии рака.
- Контроль температуры необходим для предотвращения преждевременного затвердевания матрикса.
Цель исследования
- Разработать надежный метод культивирования клеток карциномы легкого в трехмерной (3D) среде.
- Обеспечить возможность изучения взаимодействий между клетками и матриксом в исследованиях рака.
- Обеспечить формирование органоидов с ацинарно-подобными структурами для дальнейшего анализа.
Используемые методы
- Размораживание и подготовка матрикса базальной мембраны при низких температурах.
- Центрифугирование клеток рака легкого TUM622 для получения клеточного осадка.
- Смешивание клеточной суспензии с матриксом базальной мембраны.
- Перенос смеси в многолуночные планшеты и инкубация до затвердевания.
Основные результаты
- Успешное формирование однородной суспензии клеток и матрикса.
- Подтвержденное под микроскопом равномерное распределение клеток внутри матрикса.
- После инкубации сформировались органоиды с ацинарно-подобными структурами.
- Среда для 3D-культивирования способствовала росту и взаимодействию клеток.
Выводы
- Данный протокол представляет собой воспроизводимый метод трехмерного культивирования клеток карциномы легкого.
- Поддержание низких температур имеет решающее значение для сохранения целостности матрикса.
- Этот подход может углубить понимание биологии рака за счет более точного моделирования микроокружения опухоли.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол обеспечивает воспроизводимое 3D-культивирование клеток карциномы легкого для моделирования взаимодействий между клетками и матриксом, что способствует валидации мишеней при поиске противоопухолевых препаратов. Путем формирования органоидоподобных структур в матриксе базальной мембраны данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет более точного воспроизведения микроокружения опухоли. Он представляет собой масштабируемую стандартизированную систему для механистического снижения рисков при выборе терапевтических мишеней в исследованиях рака легкого.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия между опухолью и стромой, а также модуляцию сигнальных путей в физиологически релевантном контексте.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет сохранения характеристик раковых клеток благодаря сигналам внеклеточного матрикса.
- Стратегическая ценность: повышает достоверность определения мишеней, сокращая количество ложноположительных результатов, вызванных артефактами искусственного 2D-культивирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные на основе микроскопии о формировании органоидов и развитии структур, подобных ацинусам.
- Практическая ценность: стандартизирует условия анализа за счет подготовки матрицы с контролируемой температурой и равномерного распределения клеток.
- Масштабируемость: совместимость с 24-луночными планшетами и камерными предметными стеклами для визуализации со средней и высокой пропускной способностью и иммунофлуоресцентного анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными исследованиями и доклинической валидацией путем моделирования прогрессирования плоскоклеточного рака легкого в системе, соответствующей патологическим условиям заболевания.
- Механистическое снижение рисков: позволяет оценить влияние соединений на адгезию клеток к матриксу, инвазию и морфогенез органоидов.
- Прогностическая достоверность: повышает релевантность доклинических показателей за счет воссоздания трехмерной архитектуры ткани и стромальных взаимодействий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, позволяя проводить оценку мишеней на ранних этапах и оптимизацию соединений-лидеров за счет повышения биологической достоверности.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о матрикс-зависимых сигнальных путях и туморогенном потенциале.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для скрининга библиотек соединений в 3D-форматах.
- Аналитика: предоставляет морфометрические данные и измерения на основе флуоресценции для сравнения эффектов воздействия на формирование органоидов.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров за счет сохранения взаимодействий в микроокружении опухоли, критически важных для прогрессирования рака.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую платформу для разработки моделей рака легкого в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую значимость моделей рака легкого, позволяя изучать взаимодействия между клетками и матриксом.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов работы с термолабильным матриксом.
- Стратегическая ценность: снижает риск неудач на поздних этапах разработки за счет повышения биологической релевантности доклинических исследований эффективности и токсичности.
- Влияние на портфель разработок: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) благодаря повышенной точности моделей в программах по изучению рака легкого.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трехмерными (3D) культурами клеток и внеклеточным матриксом.
- Зависимость от логистики холодовой цепи и оборудования с контролем температуры для подготовки матрикса.
- Необходимость внедрения стандартизированных операционных процедур во всех рабочих группах для обеспечения однородного формирования органоидов.
- Адаптация метода для других моделей карциномы может потребовать оптимизации концентрации матрикса и плотности клеток.
- Ограничение в виде необходимости использования специализированных инструментов визуализации для оценки результатов формирования 3D-структур.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия
Похожие видео
0 Просмотры
Комбинированный 3D Tissue Engineered
Похожие видео
0 Просмотры
Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ базальной мембраны 3D-культуры: культивирование раковых клеток на белковой матрице базальной мембраны 3D для изучения клеточной инвазии
Похожие видео
0 Просмотры
3D-кокультура клеток рака легких с CAF: модельная система in vitro для изучения прогрессирования опухоли
Похожие видео
0 Просмотры
Выявление организации цитоскелета инвазивных раковых клеток в 3D
Похожие видео
0 Просмотры
Трехмерные культуры: инструмента для изучения Normal Acinar Архитектура против злокачественной трансформации клеток молочной железы
Похожие видео
0 Просмотры
Тканевая инженерия из стромальных опухолей микроокружения с применением к клеточной Рак Invasion
Похожие видео
0 Просмотры
Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель
Похожие видео
0 Просмотры
Трехмерный культура анализа для изучения раковых клеток инвазивности и Satellite Опухоль Формирование
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026