3-мерная культура клеток карциномы легкого: метод изучения клеточно-матриксных взаимодействий

- Сначала разморозьте флаконы матрицы базальной мембраны при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. Матрикс базальной мембраны состоит из белков, присутствующих в микроокружении опухоли, которые помогают поддерживать характеристики раковых клеток in vitro. На следующий день поместите флакон с базальной мембраной на лед, чтобы сохранить матрицу в жидком состоянии. Возьмите клетки рака легких в предварительно охлажденную центрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость и легкими постукивающими движениями, чтобы выбить гранулу и положить ее на лед. Далее добавьте в эту пробирку соответствующий объем смеси базальной мембраны и перемешайте, чтобы получилась равномерная клеточная суспензия. Выполняйте все действия при низкой температуре, чтобы предотвратить образование базальной мембраны.

Перенесите соответствующий объем суспензии ячеистой матрицы в центр каждой лунки в предварительно охлаждаемую луночную пластину, охватывающую всю лунку. Инкубируйте луночную пластину, чтобы матрица застыла. Исследуйте под микроскопом, чтобы убедиться в равномерном распределении клеток внутри матрицы. Добавьте в каждую лунку готовую среду для 3D-культуры и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. Эта среда облегчает взаимодействие клеточного матрикса. Таким образом, клетки образуют органоиды с ацинароподобными структурами. В соответствии с приведенным ниже протоколом мы выполним 3D-культивирование клеток карциномы легкого TUM622.

Для начала разморозьте флаконы матрицы базальной мембраны в холодильнике с температурой 4 градуса Цельсия на ночь. Охладите две миллилитровые пластиковые пипетки и наконечники при температуре минус 20 градусов Цельсия на ночь. На следующий день нагрейте реагенты, используемые для диссоциации клеток TUM622, буфер HEPES, Trypsin-EDTA и буфер для нейтрализации трипсина, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Достаньте размороженную матрицу базальной мембраны из холодильника и положите флакон на лед. Охладите планшеты для культивирования тканей на металлической платформе-холодильнике, помещенном на лед. Поместите пробирки центрифуги на металлическую решетку для охлаждения на льду. Рассчитайте количество необходимых ячеек, исходя из количества лунок и концентрации ячеек в каждой лунке, которые необходимо подготовить. Перенесите суспензию ячеек TUM622 в охлаждаемую центрифужную пробирку и вращайте со скоростью 300 g в подвешенном ведре при температуре 4 градуса Цельсия в течение пяти минут.

С помощью аспирационной пипетки, прикрепленной к нефильтрованному наконечнику, осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно 100 микролитров среды. Осторожно постучите по боковой стороне трубки, чтобы выбить и связать гранулу, а затем верните ее на решетку для охлаждения. Используя два миллилитра предварительно охлажденных пипеток, аккуратно перемешайте матрицу на льду, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Пипетку следует проводить с равномерной и умеренной скоростью, чтобы во время этой процедуры в матрицу не вводились пузырьки.

Перелейте по 1,1 миллилитра матрицы в каждую центрифужную пробирку. Используя предварительно охлажденные наконечники, пипетируйте матрицу в каждой пробирке вверх и вниз около 10 раз, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Перелейте по 310 микролитров клеточно-матричной суспензии в каждую лунку предварительно охлажденного 24-луночного планшета. Поместите пипетку под углом 90 градусов к поверхности пластины и добавьте суспензию к центру лунки. Суспензия распространяется и покрывает весь колодец. Чтобы облегчить последующий иммунофлуоресцентный анализ, перенесите 60 микролитров суспензии клеточного матрикса в центр лунки предметного стекла с 2-луночной камерой. Это позволяет матрице образовывать куполообразную структуру с гораздо меньшим объемом.

Верните планшет и камеру, вставьте обратно в инкубатор для культуры тканей и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы матрица затвердела. После этого осмотрите пластину и проведите под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отдельные клетки равномерно распределены внутри матрицы. Добавьте 1 миллилитр предварительно подогретой 3D питательной среды в каждую лунку планшета и 1,5 миллилитра 3D питательной среды в каждую лунку предметного стекла камеры. Затем верните их в инкубатор.