3D-кокультура клеток рака легких с CAF: модельная система in vitro для изучения прогрессирования опухоли

- В 3D-кокультурах несколько типов клеток выращиваются вместе в матрицах, таких как матрица базальной мембраны, которая имитирует естественное микроокружение внеклеточного матрикса, способствуя межклеточному взаимодействию и взаимодействию между клетками. Для создания встроенной 3D кокультуры готовят однородную суспензию из ассоциированных с раком фибробластов или CAF и клеток рака легких, взятых в соотношении два к одному, в матрице базальной мембраны. Удерживайте суспензию на льду, чтобы предотвратить затвердевание матрицы при температуре окружающей среды.

Перенесите соответствующий объем суспензии в планшет для клеточной культуры. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение необходимого времени для совместного встраивания клеток в матрикс. Чтобы создать наложенную 3D-кокультуру, приготовьте суспензию клеток рака легких в матриксе базальной мембраны с желаемой плотностью клеток. Поддерживайте подвеску на льду. Пипеткой введите соответствующий объем этой суспензии клеточного матрикса в планшет для культивирования клеток. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия, чтобы создать монокультуру встроенных раковых клеток.

Затем перенесите желаемый объем CAF, взвешенных в предпочтительных питательных средах, над внедренными раковыми клетками. В 3D-кокультурах CAF усиливают образование сфероидов раковыми клетками и привлекают раковые клетки, что приводит к образованию каплевидных структур. В рамках этого протокола мы будем совместно культивировать клетки рака легких TUM622 и CAF для изучения их взаимодействия.

- После приготовления клеточных суспензий TUM622 и CAFs, как описано ранее, подсчитайте плотность клеток CAF, смешав 10 микролитров клеточной суспензии с 10 микролитрами трипанового синего. Добавьте по 10 микролитров смеси в каждую из двух камер на гемоцитометре для подсчета и расчета плотности клеток. Чтобы совместно встроить клетки TUM622 и CAF в матрицу базальной мембраны, сначала рассчитайте желаемое количество ячеек, используемых для покрытия, на основе информации о плотности клеток. CAF высеваются в соотношении клеток TUM622 в соотношении 2 к 1. Переведите расчетный объем TUM622, а также суспензию клеток CAF, в ту же центрифужную пробирку. Вращаем вниз и аспирируем все средние. Повторно суспендируйте в базальную мембранную матрицу и планшет по 310 микролитров смеси в каждую лунку 24-луночного планшета. Для иммунофлюоресценции перенесите 60 микролитров смесей TUM622 и CAF на предметные стекла камеры, как описано ранее.

Для совместного культивирования TUM622 с наложенными CAF в матрице базальной мембраны сначала создали монокультуру TUM622, как описано ранее. Перелейте удвоенное количество суспензии CAF в центрифужную пробирку и вращайте со скоростью 300 «g» в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте CAF в одном миллилитре 3D-питательной среды. Перелейте одну миллилитровую суспензию CAF в лунку, содержащую встроенные клетки TUM622.