Почему определение IC50 имеет критическое значение перед повышением дозы?

Определение базового значения IC50 с помощью МТТ-теста позволяет установить эталонную концентрацию для начала повышения дозы с уровня 1/10 IC50, что обеспечивает создание селективного давления без немедленной цитотоксичности. Это способствует постепенному развитию резистентности с течением времени, предотвращая острую гибель клеток.

Как результаты МТТ-анализа позволяют судить о развитии резистентности?

МТТ-тест позволяет измерить выработку формазана за счет активности митохондриальной редуктазы в жизнеспособных клетках, при этом оптическая плотность при 570 nm коррелирует с количеством клеток; резистентность подтверждается, когда клетки сохраняют жизнеспособность при повышении концентраций афатиниба, которые изначально подавляли рост.

Что обеспечивает надежное воспроизведение процесса создания резистентных клеточных линий?

Поэтапное повышение дозы при субконфлюэнтном состоянии клеток с увеличением концентрации на 10-20% при каждом пассаже обеспечивает стандартизированный протокол селективного давления, который может быть воспроизведен в разных лабораториях для создания изогенных резистентных моделей.

Почему требования к репликации имеют важное значение для межфункционального взаимодействия?

Стабильное развитие резистентности во всех повторностях подтверждает, что наблюдаемые фенотипы обусловлены генетически, а не стохастически, что обеспечивает надежную передачу данных от групп по поиску и разработке методов анализа к доклиническим группам для проведения исследований по валидации мишеней.

Какой статистический анализ необходим для подтверждения развития резистентности?

Резистентность подтверждается путем сравнения кривых жизнеспособности, полученных с помощью МТТ-теста, для родительских клеток и клеток, подвергнутых воздействию возрастающих доз препарата; для демонстрации снижения чувствительности к препарату с течением времени требуется проведение статистического анализа (например, анализ сдвига IC50).

Эскалация дозы: метод развития лекарственной устойчивости в раковых клетках

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 4:17 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Ингибиторы тирозинкиназы, ИТК, блокируют связывание рецептора киназы с АТФ, предотвращая фосфорилирование. Начните с осаждения раковых клеток в питательную среду. Дайте им достичь благоприятной плотности, и перенесите ячейки в несколько лунок. После ночного роста распределите различные концентрации препарата в нескольких лунках и дайте клеткам расти в течение желаемого времени. Добавьте МТТ, водорастворимый краситель, чтобы измерить жизнеспособность клеток. Митохондриальные ферменты превращают МТТ в нерастворимый фиолетовый формазан внутри живых клеток.

Остановите реакцию, добавив подходящий солюбилизирующий агент, и измерьте формазан спектрофотометрическим способом. Этот метод называется анализом МТТ. Постройте график живых клеток, обозначенных формазаном, в зависимости от концентраций препарата. Рассчитайте ингибиторную концентрацию, IC₅₀, найдя концентрацию препарата, которая убивает 50% клеток с помощью программного обеспечения.

Затем вырастите раковые клетки в питательной среде и распределите их по трем разным тарелкам. После того как клетки достигнут субконфлюенции, добавляют 1/10 разведения концентрации IC₅₀. Дайте клеткам расти и проведите анализ МТТ. Повторите этот процесс с увеличением дозировки препарата. Раковые клетки медленно развивают устойчивость к ИТК из-за мутаций в белковой последовательности.

Следующий протокол показывает развитие резистентности к афатинибу в клетках PC9 путем повышения дозы.

- Чтобы определить подходящую концентрацию резистентности к афатинибу, культивируйте клетки PC9 в питательной среде в 10-сантиметровой чашке, обработанной клеточной культурой, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Ресуспендируйте клетки PC9 в соотношении от 4 до 4 клеток на миллилитр концентрации питательной среды и засейте клетки в дозе 50 микролитров клеточной суспензии на лунку в 96-луночный микропланшет. После ночной инкубации в инкубаторе для клеточных культур обработайте клетки 50 микролитрами раствора афатиниба на лунку в шести повторениях указанных концентраций. А после 96-часовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур добавьте в каждую лунку по 15 микролитров красителя МТТ.

Через четыре часа в инкубаторе для клеточных культур добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора для остановки солюбилизации и верните планшет в инкубатор на ночь. На следующее утро измерьте оптическую плотность на 570 нанометрах на микропланшетном ридоре. Для непрерывного воздействия афатиниба культивируют клетки PC9 в чашках P100, содержащих 10 миллилитров питательной среды, до тех пор, пока клетки не достигнут субконфлюенции.

Перенесите субконфлюентные культуры в три новые чашки P100 по 9 миллилитров питательной среды на начальную чашку для культивирования и верните клетки в инкубатор для клеточных культур. На следующее утро добавьте 0,1 наномоляра или 1/10 от половины максимальной ингибирующей концентрации афатиниба в каждый набор из трех тарелок для культивирования. Когда клетки, обработанные афатинибом, становятся субконфлирующимися, используйте пипетку объемом 1 миллилитр для тщательного перемешивания культур и переносите 1 миллилитр клеток из каждой чашки в 9 миллилитров свежей питательной среды в новых чашках P100.

Добавляйте на 10–20% более высокие концентрации афатиниба в новые культуры, увеличивая концентрацию афатиниба путем постепенного увеличения дозы каждый раз, когда культуры достигают субконфлюенции в течение 10–12 месяцев. Когда концентрация афатиниба в 1 микромоляр достигнута, проведите анализ МТТ, как показано, чтобы подтвердить, что клетки развили устойчивость к афатинибу.