Анализ экстракции РНК: метод извлечения РНК из клеток рака легких, трансфицированных микроРНК

- Для начала поместите клетки рака легких в Т-образную колбу, содержащую питательную среду для тканей, и дайте ей вырасти в течение ночи. Далее суспендируйте микроРНК с трансфективным агентом в трансфективную среду. Удалите среду и добавьте трансфицирующую среду, которая будет вводить микроРНК в раковые клетки. МикроРНК — это некодирующая молекула РНК, которая связывается с комплементарной последовательностью мРНК и блокирует экспрессию генов. Инкубируйте колбу в течение желаемого времени.

Затем замените среду средой для тканевых культур и выращивайте в течение ночи. Добавьте трипсин для диссоциации клеток. Переложите смесь в центрифужную пробирку, содержащую PBS, и центрифугируйте ее. Удалите надосадочную жидкость и добавьте буфер для лизиса к клеткам лизиса и добавьте ультрачистый этанол для осаждения. Поместите смесь в разделительную колонку для очистки нуклеиновой кислоты и центрифугируете.

Удалите сквозной поток и добавьте промывочный буфер для удаления лизированной клеточной мембраны и центрифугу. Снимите промывочный буфер и добавьте ДНКазу с буфером для разложения ДНКазы, чтобы удалить ДНК из образца и центрифуги. Добавьте буфер для подготовки РНК для выделения РНК и центрифугу. Соберите РНК, присутствующую в надосадочной жидкости. В следующем протоколе мы выполним экстракцию РНК из клеток рака легких, обработанных микроРНК.

- Во-первых, поместите раковые клетки в соответствующую колбу, достаточную для экстракции РНК и белка для выполнения экспрессии генов с помощью количественной ПЦР или микрочипового анализа. Затем инкубируйте в течение ночи с питательной средой с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина.

На следующий день образец микроРНК готовят к трансфекции путем разведения микроРНК 143 и микроРНК 506 в среде в концентрации 100 наномоляров каждая. Выньте колбу из инкубатора, и извлеките фильтрующий материал. Умойтесь 1 x PBS.

Все необработанные контрольные элементы будут содержать только неполные среды с клетками. Инкубируйте клетки с трансфекционными средами в течение шести часов в инкубаторе. Через шесть часов удалите носитель и замените его 4 миллилитрами свежего готового средства. Соберите клетки через 24 часа и 48 часов с помощью трипсинизации.

Затем дважды промойте 1x PBS в каждой тюбике и удалите надосадочную жидкость. Для того, чтобы провести экстракцию РНК в более позднее время, заморозьте клетки при температуре минус 80 градусов Цельсия.

- Экстракцию РНК проводили с помощью набора РНК в соответствии с инструкциями производителя. Сначала снимите трубки с температуры минус 80 градусов по Цельсию и дайте оттаять.

- Добавьте 300 микролитров буфера для лизиса и пипеткой вверх и вниз, чтобы разрушить клеточную мембрану. Добавьте равный объем 100% ультрачистого этанола. Затем хорошо перемешайте и поместите в разделительную колонну. Центрифугируйте и удалите сквозной поток.

Добавьте 400 микролитров промывочного буфера и центрифугу, чтобы удалить буфер. Добавьте 5 микролитров ДНКазы I с 75 микролитрами буфера для расщепления ДНК в каждый образец и инкубируйте в течение 15 минут. Затем промойте образец буфером для подготовки РНК объемом 400 микролитров.

Затем дважды промойте буфером для промывки РНК. Теперь добавьте в колонку воду без нуклеаз, центрифугуйте и затем соберите РНК. Измерьте концентрацию РНК, на этом этапе 2 микрограмма образца РНК могут быть отправлены на секвенирование РНК.