Анализ клеточного цикла: подход к изучению регуляции клеточного цикла клеток рака легкого, трансфицированных микроРНК
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:34 мин • April 30th, 2023
- МикроРНК или микроРНК — это маленькая некодирующая РНК. После трансфекции или введения мРНК в клетку она образует белковый комплекс микроРНК. Комплекс нацелен на специфическую мРНК и связывается с ней, а также негативно регулирует ее экспрессию, останавливая прогрессию клеточного цикла.
Чтобы начать анализ, добавьте подходящий дегидратирующий фиксатор к собранной культуре клеток рака легких, трансфицированных микроРНК. Фиксатор сохраняет клетки, а также проникает в клеточную мембрану. Обработайте клетки смесью йодида пропидия, флуоресцентного красителя нуклеиновой кислоты и фермента рибонуклеазы.
Краситель проникает в клетки и окрашивает как ДНК, так и РНК. Ферменты специфически разрушают РНК, обеспечивая оптимальное количественное определение ДНК. Используйте проточный цитометр для определения доли клеток, остановленных в различных фазах клеточного цикла, на основе интенсивности флуоресценции отдельных клеток.
Клетки в фазах покоя и роста имеют более низкое содержание ДНК и, следовательно, меньшую интенсивность флуоресценции. Клетки в фазе Gap 2 с удвоенным количеством ДНК производят в два раза большую интенсивность флуоресценции. Клетки в фазе синтеза ДНК индуцируют значение флуоресценции между двумя другими популяциями. В следующем протоколе будет проанализирована регуляция клеточного цикла клеток рака легких, обработанных микроРНК, путем измерения содержания в них ДНК с помощью окрашивания PI и проточной цитометрии.
- Трансфектируйте клетки, как описано в предыдущем разделе этого видео. Соберите клетки из каждого образца в отдельные 15-миллилитровые стерильные пробирки методом трипсинизации. Далее дважды промойте клетки 1X PBS центрифугированием при 751 г в течение 5 минут, а затем удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте и разбейте гранулу, добавив 200 микролитров ледяного 1X PBS через пипетирование.
Добавьте 2 миллилитра 70% ледяного этанола по каплям в трубку, осторожно переворачивая трубку, чтобы зафиксировать клетки. Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре и поместите их в 4 градуса Цельсия на 1 час. Снимите пробирки от 4 градусов Цельсия и центрифугируйте.
Добавьте 2 мл ледяного PBS и вортекс, а затем удалите надосадочную жидкость центрифугированием. Добавьте в каждый образец 500 микролитров 1X PBS, содержащего йодид пропидия и рибонуклеазу А с концентрациями 50 и 200 микрограмм на миллилитр соответственно и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Переложите образцы в соответствующие пробирки, защищающие от света, и запустите на проточном цитометре.
Обзор
В данном исследовании изучается роль микроРНК (миРНК) в регуляции клеточного цикла клеток рака легкого. С помощью проточной цитометрии и окрашивания пропидиумйодидом работа направлена на количественное определение содержания ДНК и анализ фаз клеточного цикла в клетках, обработанных миРНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Онкология
- Исследования микроРНК
Теоретические основы
- МикроРНК представляют собой малые некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов.
- Они играют ключевую роль в различных клеточных процессах, включая клеточный цикл.
- Понимание влияния miRNA на клетки рака легкого может дать ценные сведения о биологии рака.
- Проточная цитометрия является мощным инструментом для анализа динамики клеточного цикла.
Цель исследования
- Анализ влияния миРНК на клеточный цикл клеток рака легкого.
- Измерение содержания ДНК с помощью окрашивания пропидиййодидом.
- Определение доли клеток в различных фазах клеточного цикла.
Используемые методы
- Трансфекция клеток рака легкого микроРНК.
- Сбор и фиксация клеток с использованием дегидратирующего фиксатора.
- Окрашивание клеток пропидиййодидом и обработка рибонуклеазой.
- Анализ методом проточной цитометрии для оценки интенсивности флуоресценции и содержания ДНК.
Основные результаты
- Клетки на разных фазах клеточного цикла демонстрировали различную интенсивность флуоресценции.
- Клетки в состоянии покоя и в фазе роста имели более низкое содержание ДНК.
- Клетки в фазе G2 обладали интенсивностью флуоресценции в два раза выше, чем клетки в состоянии покоя.
- Клетки в фазе синтеза ДНК демонстрировали промежуточные значения флуоресценции.
Выводы
- трансфекция микроРНК существенно влияет на прогрессию клеточного цикла клеток рака легкого.
- Проточная цитометрия эффективна для анализа фаз клеточного цикла на основе содержания ДНК.
- Понимание роли микроРНК может привести к разработке новых терапевтических стратегий в лечении рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественный анализ клеточного цикла клеток рака легкого, трансфицированных miRNA, позволяет точно исследовать механизмы регуляции клеточного цикла, имеющие значение для разработки онкологических препаратов. Измерение содержания ДНК методом проточной цитометрии предоставляет ценные данные для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних стадиях терапевтических программ. Данный подход повышает точность прогнозов в ключевых точках разработки препаратов в области онкологии.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет проводить прямую оценку вызванного miRNA ареста клеточного цикла в релевантных моделях рака.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней регуляции клеточного цикла с помощью количественного анализа содержания ДНК.
- Способствует снижению механистических рисков за счет дифференциации эффектов на конкретных фазах клеточного цикла.
- Предоставляет прогностические данные для отбора перспективных кандидатов из miRNA в онкологических портфелях.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает стандартизированный, воспроизводимый метод проточной цитометрии для количественного определения фаз клеточного цикла.
- Обеспечивает количественные результаты, подходящие для высокопроизводительного скрининга библиотек miRNA или химических соединений.
- Позволяет проводить надежное сравнение воздействий, ингибирующих пролиферацию, в различных экспериментальных группах.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для более широкого применения в онкологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные об остановке клеточного цикла in vitro с доклиническими моделями ингибирования роста опухоли.
- Обеспечивает преемственность между механистическими исследованиями на этапе поиска и разработкой трансляционных биомаркеров.
- Служит основой для принятия решений о продвижении терапевтических кандидатов на основе miRNA с учетом рисков.
- Повышает прогностическую значимость последующих исследований эффективности в онкологических программах разработки.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая как валидацию мишеней, так и идентификацию ведущих соединений в онкологических исследованиях.
- Биология открытий: Позволяет количественно оценить влияние miRNA на прогрессию клеточного цикла, проясняя регуляторные пути в раковых клетках.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для оценки потенциальных miRNA или соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение распределения фаз клеточного цикла при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты изучения механизмов in vitro с доклиническими моделями роста опухоли при наличии подтверждающих данных.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированный анализ, который можно адаптировать для различных линий раковых клеток и мишеней miRNA.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в онкологических программах, направленных на клеточный цикл.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы анализа клеточного цикла.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределение капитала за счет предоставления надежных механистических данных.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней miRNA и регуляторов клеточного цикла в онкологических пайплайнах с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии и методов трансфекции нуклеиновых кислот.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и реагентам для количественного определения ДНК на основе флуоресценции.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и анализа данных.
- Метод применим к различным линиям раковых клеток при условии оптимизации протокола для конкретных модельных систем.
- Точность количественной оценки фаз зависит от строгого контроля деградации РНК и окрашивания ДНК.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Временная Отслеживание клеточного цикла прогрессии Использование проточной цитометрии без необходимости синхронизации
Похожие видео
0 Просмотры
Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов
Похожие видео
0 Просмотры
Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ экстракции РНК: метод извлечения РНК из клеток рака легких, трансфицированных микроРНК
Похожие видео
0 Просмотры
Микрочип антител: метод изучения экспрессии белка клеток рака легких, обработанных микроРНК
Похожие видео
0 Просмотры
Профилирование Эстроген-регулируемых микроРНК в клетках рака молочной железы
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ клинико-патологическими микроРНК выражения при раке молочной железы ТКАНЕЙ с помощью микроРНК
Похожие видео
0 Просмотры
Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ комбинаторной Мирна процедуры регулируют клеточный цикл и ангиогенез
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026