Анализ клеточного цикла: подход к изучению регуляции клеточного цикла клеток рака легкого, трансфицированных микроРНК

- МикроРНК или микроРНК — это маленькая некодирующая РНК. После трансфекции или введения мРНК в клетку она образует белковый комплекс микроРНК. Комплекс нацелен на специфическую мРНК и связывается с ней, а также негативно регулирует ее экспрессию, останавливая прогрессию клеточного цикла.

Чтобы начать анализ, добавьте подходящий дегидратирующий фиксатор к собранной культуре клеток рака легких, трансфицированных микроРНК. Фиксатор сохраняет клетки, а также проникает в клеточную мембрану. Обработайте клетки смесью йодида пропидия, флуоресцентного красителя нуклеиновой кислоты и фермента рибонуклеазы.

Краситель проникает в клетки и окрашивает как ДНК, так и РНК. Ферменты специфически разрушают РНК, обеспечивая оптимальное количественное определение ДНК. Используйте проточный цитометр для определения доли клеток, остановленных в различных фазах клеточного цикла, на основе интенсивности флуоресценции отдельных клеток.

Клетки в фазах покоя и роста имеют более низкое содержание ДНК и, следовательно, меньшую интенсивность флуоресценции. Клетки в фазе Gap 2 с удвоенным количеством ДНК производят в два раза большую интенсивность флуоресценции. Клетки в фазе синтеза ДНК индуцируют значение флуоресценции между двумя другими популяциями. В следующем протоколе будет проанализирована регуляция клеточного цикла клеток рака легких, обработанных микроРНК, путем измерения содержания в них ДНК с помощью окрашивания PI и проточной цитометрии.

- Трансфектируйте клетки, как описано в предыдущем разделе этого видео. Соберите клетки из каждого образца в отдельные 15-миллилитровые стерильные пробирки методом трипсинизации. Далее дважды промойте клетки 1X PBS центрифугированием при 751 г в течение 5 минут, а затем удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте и разбейте гранулу, добавив 200 микролитров ледяного 1X PBS через пипетирование.

Добавьте 2 миллилитра 70% ледяного этанола по каплям в трубку, осторожно переворачивая трубку, чтобы зафиксировать клетки. Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре и поместите их в 4 градуса Цельсия на 1 час. Снимите пробирки от 4 градусов Цельсия и центрифугируйте.

Добавьте 2 мл ледяного PBS и вортекс, а затем удалите надосадочную жидкость центрифугированием. Добавьте в каждый образец 500 микролитров 1X PBS, содержащего йодид пропидия и рибонуклеазу А с концентрациями 50 и 200 микрограмм на миллилитр соответственно и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Переложите образцы в соответствующие пробирки, защищающие от света, и запустите на проточном цитометре.