Подготовка легких мыши к проточной цитометрии: получение клеточной суспензии из легочной ткани для проточного цитометрического анализа

- Начните с того, что возьмите усыпленную мышь и закрепите ее на доске для вскрытия с помощью лабораторного скотча. С помощью ножниц разрежьте кожу. Сделайте вертикальный разрез через диафрагму и разрежьте ребра, чтобы добраться до грудной полости, обнажая сердце и легкие. Далее сделайте небольшой разрез в левом желудочке сердца. Затем найдите правый желудочек и введите шприц, содержащий PBS, в просвет желудочка. Перфузируйте PBS через правый желудочек, позволяя крови вытекать из предварительно сделанного разреза в левом желудочке до тех пор, пока легкие не станут белыми. Извлеките легочную ткань, содержащую опухолевые узелки, и измельчите на мелкие кусочки.

Инкубируйте кусочки в буфере для переваривания легких. Коллагеназа в буфере для пищеварения легких помогает изолировать клетки, а ДНКаза помогает удалить ДНК из мертвых клеток. Полученную суспензию процедите через клеточное ситечко, чтобы удалить комки и сделать клеточную суспензию равномерной. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в буфере хлорида аммония и калия для лизиса остаточных эритроцитов. Центрифуга для сбора лейкоцитов и опухолевых клеток в гранулах. Ресуспендируйте гранулу в PBS с добавлением FCS, для поддержания стабильности клеток. В следующем протоколе мы продемонстрируем приготовление суспензии клеток легких для проточного цитометрического анализа.

После соответствующей экспериментальной конечной точки замочите тушу в 70% этаноле и закрепите животное на доске для вскрытия. Сделайте вентральный разрез по средней линии и аккуратно переверните кожу, чтобы обнажить мышцы грудной стенки и органы брюшной полости. С помощью ножниц проколите диафрагму и разрежьте ребра, обнажающие грудную полость. Вырежьте небольшое отверстие в левом желудочке и с помощью иглы 27 калибра трижды перфузируйте легкое через правый желудочек с помощью от 6 до 8 миллилитров ледяного PBS за одну инфузию. После последней перфузии легкие должны быть полностью очищены от крови и казаться белыми. После сбора урожая с помощью ножниц измельчите легочную ткань на мелкие кусочки.

Перенесите фрагменты легких в микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра, содержащую 1,5 миллилитров буфера для разложения легких, для инкубации от 30 до 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. В конце разложения перенесите клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 микрон в 50-миллилитровую трубку и используйте конец стерильного 10-миллилитрового поршня шприца, чтобы продавить любые оставшиеся фрагменты ткани через фильтр. Промойте ситечко 15 миллилитрами PBS с добавлением 2% FCS, и соберите клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре буфера для лизиса хлорида аммония на 5-минутную инкубацию при комнатной температуре, и снова центрифугируйте клетки. Затем повторно суспендируют гранулу лейкоцитов в 1 миллилитре PBS с добавлением 2% FCS, и окрашивают клетки для проточного цитометрического анализа согласно протоколу эксперимента.