Почему проверка нулевой гипотезы важна для проточной цитометрии PD-L1?

Проверка нулевой гипотезы при проведении проточной цитометрии PD-L1 позволяет объективно оценить, имеет ли наблюдаемая экспрессия маркера значимые отличия между экспериментальными группами, что способствует строгой валидации мишеней и снижению количества ложноположительных результатов на ранних этапах поиска.

Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочие процессы приготовления суспензии клеток легких?

Изоляция таких переменных, как концентрация фермента и время инкубации, гарантирует, что изменения в выходе клеток или экспрессии маркеров обусловлены экспериментальными условиями, что повышает воспроизводимость и интерпретируемость в процессах поиска и разработки.

Что позволяют определить количественные измерения методом проточной цитометрии в моделях легких?

Количественная проточная цитометрия предоставляет точные данные о популяциях клеток и экспрессии маркеров, что позволяет проводить сравнительный анализ в различных условиях и принимать обоснованные решения в исследованиях в области иммуноонкологии.

Почему требования к репликации имеют критическое значение для протоколов подготовки клеток легких?

Репликация гарантирует, что результаты изоляции клеток и проточной цитометрии остаются согласованными в разных экспериментах и группах исследователей, что способствует кросс-функциональному сотрудничеству и надежному продвижению доклинических программ.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед проведением исследований PD-L1 методом проточной цитометрии?

Для интерпретации данных проточной цитометрии, оценки значимости различий в экспрессии маркеров и принятия решений о целесообразности дальнейших действий в рабочих процессах валидации мишеней необходим надежный статистический анализ.

Подготовка легких мыши к проточной цитометрии: получение клеточной суспензии из легочной ткани для проточного цитометрического анализа

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 3:48 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Начните с того, что возьмите усыпленную мышь и закрепите ее на доске для вскрытия с помощью лабораторного скотча. С помощью ножниц разрежьте кожу. Сделайте вертикальный разрез через диафрагму и разрежьте ребра, чтобы добраться до грудной полости, обнажая сердце и легкие. Далее сделайте небольшой разрез в левом желудочке сердца. Затем найдите правый желудочек и введите шприц, содержащий PBS, в просвет желудочка. Перфузируйте PBS через правый желудочек, позволяя крови вытекать из предварительно сделанного разреза в левом желудочке до тех пор, пока легкие не станут белыми. Извлеките легочную ткань, содержащую опухолевые узелки, и измельчите на мелкие кусочки.

Инкубируйте кусочки в буфере для переваривания легких. Коллагеназа в буфере для пищеварения легких помогает изолировать клетки, а ДНКаза помогает удалить ДНК из мертвых клеток. Полученную суспензию процедите через клеточное ситечко, чтобы удалить комки и сделать клеточную суспензию равномерной. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в буфере хлорида аммония и калия для лизиса остаточных эритроцитов. Центрифуга для сбора лейкоцитов и опухолевых клеток в гранулах. Ресуспендируйте гранулу в PBS с добавлением FCS, для поддержания стабильности клеток. В следующем протоколе мы продемонстрируем приготовление суспензии клеток легких для проточного цитометрического анализа.

После соответствующей экспериментальной конечной точки замочите тушу в 70% этаноле и закрепите животное на доске для вскрытия. Сделайте вентральный разрез по средней линии и аккуратно переверните кожу, чтобы обнажить мышцы грудной стенки и органы брюшной полости. С помощью ножниц проколите диафрагму и разрежьте ребра, обнажающие грудную полость. Вырежьте небольшое отверстие в левом желудочке и с помощью иглы 27 калибра трижды перфузируйте легкое через правый желудочек с помощью от 6 до 8 миллилитров ледяного PBS за одну инфузию. После последней перфузии легкие должны быть полностью очищены от крови и казаться белыми. После сбора урожая с помощью ножниц измельчите легочную ткань на мелкие кусочки.

Перенесите фрагменты легких в микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра, содержащую 1,5 миллилитров буфера для разложения легких, для инкубации от 30 до 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. В конце разложения перенесите клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 микрон в 50-миллилитровую трубку и используйте конец стерильного 10-миллилитрового поршня шприца, чтобы продавить любые оставшиеся фрагменты ткани через фильтр. Промойте ситечко 15 миллилитрами PBS с добавлением 2% FCS, и соберите клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре буфера для лизиса хлорида аммония на 5-минутную инкубацию при комнатной температуре, и снова центрифугируйте клетки. Затем повторно суспендируют гранулу лейкоцитов в 1 миллилитре PBS с добавлением 2% FCS, и окрашивают клетки для проточного цитометрического анализа согласно протоколу эксперимента.