Иммунофлуоресцентный анализ: метод идентификации опухолевых клеток, захваченных на медицинской проволоке

- Возьмем функционализированную проволоку с небольшим золотым участком, покрытым гидрогелем, в сочетании с антителами, представляющими интерес. Опустите золотую часть проволоки во флакон, содержащий опухолевые клетки. Закройте его проволочным стопором, и инкубируйте в ротаторе для трубок. Циркулирующие опухолевые клетки или ЦОК, отображающие поверхностные антигены, связываются с антителами на проволоке. Промойте проволоку, погрузив во флаконы, содержащие фосфатно-солевой раствор или PBS, и высушите на воздухе. Теперь опустите проволоку в раствор ацетона, чтобы зафиксировать клетки, обезвожив их.

Затем аккуратно вставьте проволоку через наконечник P200 с функциональной частью внутри него. Заполните ленту антителом, конъюгированным с флуорохромом, чтобы погрузить проволоку. Эти меченые антитела будут связываться с соответствующими антигенами, присутствующими на клетках. Запечатайте отверстие лабораторной пленкой и выдержите ночь в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. Затем промойте проволоку PBS, чтобы удалить все несвязанные антитела. Поместите провод в держатель для проводов и рассматривайте под флуоресцентным микроскопом. ЦОК, связанные антителами, флуоресцируют на проволоке. В следующем протоколе мы будем захватывать ЦОК на медицинской проволоке и идентифицировать их с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.

- Чтобы начать эксперимент, повторно суспензируйте все содержимое колбы T75, которое находится на 80% конфлюенции во флаконе объемом 5 миллилитров, используя 4 миллилитра готовой среды. Далее извлеките провод из его стеклянной упаковки. Опустите функционализированную золотую часть проволоки во флакон, убедившись, что стопор проволоки является водонепроницаемым прилеганием к флакону объемом 5 миллилитров. Заклейте провод лабораторной пленкой. Затем инкубируйте проволоку в трубчатом ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре. После вращения трижды промойте провод в одном створке раствором PBS с помощью трех разных чистых флаконов и подождите, пока провод высохнет.

После сушки проволоки на воздухе в течение 10 минут в вытяжке зафиксировать ячейки, опустив проволоку в 100% раствор ацетона в 5-миллилитровую пробирку на 10 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что на функционализированном наконечнике нет следов ацетона. Просушите проволоку на воздухе в течение 5 минут при комнатной температуре. Далее в трубке объемом 5 миллилитров промойте провод дважды в одном сгибе ПБС. Инкубируйте проволоку в буфере для разведения антител.

Приготовьте 150 мкл смеси антител с разведением моноклонального первичного антитела, конъюгированного с флуорохромом и буфером для разведения антител, как указано в техническом описании. Затем с помощью наконечника P200 извлеките проволоку из стопора проволоки и аккуратно вставьте проволоку через большее отверстие наконечника. Сначала вставьте нефункциональный конец и медленно протяните проволоку через меньшее отверстие, пока золотая часть не окажется сразу за большим отверстием. Аккуратно добавьте 150 микролитров смеси антител в наконечник.

Чтобы избежать риска образования пузырей, осторожно поворачивайте проволоку до тех пор, пока функционализированный конец полностью не погрузится. Заклейте отверстие наконечника и оберните отверстие лабораторной пленкой. Инкубируйте проволоку вертикально на ночь в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. На второй день заблокируйте инкубацию антител, промыв проволоку дважды в одном сгибе PBS. Вставьте проволоку обратно в стопор для проволоки.