JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:32 мин • April 30th, 2023
- Возьмем функционализированную проволоку с небольшим золотым участком, покрытым гидрогелем, в сочетании с антителами, представляющими интерес. Опустите золотую часть проволоки во флакон, содержащий опухолевые клетки. Закройте его проволочным стопором, и инкубируйте в ротаторе для трубок. Циркулирующие опухолевые клетки или ЦОК, отображающие поверхностные антигены, связываются с антителами на проволоке. Промойте проволоку, погрузив во флаконы, содержащие фосфатно-солевой раствор или PBS, и высушите на воздухе. Теперь опустите проволоку в раствор ацетона, чтобы зафиксировать клетки, обезвожив их.
Затем аккуратно вставьте проволоку через наконечник P200 с функциональной частью внутри него. Заполните ленту антителом, конъюгированным с флуорохромом, чтобы погрузить проволоку. Эти меченые антитела будут связываться с соответствующими антигенами, присутствующими на клетках. Запечатайте отверстие лабораторной пленкой и выдержите ночь в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. Затем промойте проволоку PBS, чтобы удалить все несвязанные антитела. Поместите провод в держатель для проводов и рассматривайте под флуоресцентным микроскопом. ЦОК, связанные антителами, флуоресцируют на проволоке. В следующем протоколе мы будем захватывать ЦОК на медицинской проволоке и идентифицировать их с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Чтобы начать эксперимент, повторно суспензируйте все содержимое колбы T75, которое находится на 80% конфлюенции во флаконе объемом 5 миллилитров, используя 4 миллилитра готовой среды. Далее извлеките провод из его стеклянной упаковки. Опустите функционализированную золотую часть проволоки во флакон, убедившись, что стопор проволоки является водонепроницаемым прилеганием к флакону объемом 5 миллилитров. Заклейте провод лабораторной пленкой. Затем инкубируйте проволоку в трубчатом ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре. После вращения трижды промойте провод в одном створке раствором PBS с помощью трех разных чистых флаконов и подождите, пока провод высохнет.
После сушки проволоки на воздухе в течение 10 минут в вытяжке зафиксировать ячейки, опустив проволоку в 100% раствор ацетона в 5-миллилитровую пробирку на 10 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что на функционализированном наконечнике нет следов ацетона. Просушите проволоку на воздухе в течение 5 минут при комнатной температуре. Далее в трубке объемом 5 миллилитров промойте провод дважды в одном сгибе ПБС. Инкубируйте проволоку в буфере для разведения антител.
Приготовьте 150 мкл смеси антител с разведением моноклонального первичного антитела, конъюгированного с флуорохромом и буфером для разведения антител, как указано в техническом описании. Затем с помощью наконечника P200 извлеките проволоку из стопора проволоки и аккуратно вставьте проволоку через большее отверстие наконечника. Сначала вставьте нефункциональный конец и медленно протяните проволоку через меньшее отверстие, пока золотая часть не окажется сразу за большим отверстием. Аккуратно добавьте 150 микролитров смеси антител в наконечник.
Чтобы избежать риска образования пузырей, осторожно поворачивайте проволоку до тех пор, пока функционализированный конец полностью не погрузится. Заклейте отверстие наконечника и оберните отверстие лабораторной пленкой. Инкубируйте проволоку вертикально на ночь в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. На второй день заблокируйте инкубацию антител, промыв проволоку дважды в одном сгибе PBS. Вставьте проволоку обратно в стопор для проволоки.
В данной статье описывается метод захвата циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с использованием функционализированной проволоки, покрытой антителами. Процесс включает инкубацию проволоки с опухолевыми клетками с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием для идентификации связанных ЦОК.
Иммунофлуоресцентный анализ циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), захваченных на функционализированных медицинских проволоках, позволяет напрямую идентифицировать редкие опухолевые клетки из крови пациента in situ. Данный подход решает критическую задачу на этапе открытия, предоставляя надежную платформу для валидации мишеней и снижения механистических рисков в онкологических разработках. Этот метод повышает прогностическую достоверность на стыке ранних этапов открытия и трансляционных исследований, что способствует принятию обоснованных решений по управлению рисками в портфеле проектов.
Данный метод иммунофлуоресцентного анализа интегрируется в непрерывный процесс онкологических исследований — от ранней валидации мишеней до доклинических исследований, позволяя проводить прямое измерение CTC в качестве трансляционных биомаркеров.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026