$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Начните с помещения тонкого участка ткани в раствор аммиака, чтобы обеспечить бережное извлечение антигена. Перенесите сечение на предметное стекло с полилизиновым покрытием. Отрицательно заряженные клетки связываются с положительно заряженным полилизином. Далее добавьте перекись водорода, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы. Промойте предметное стекло в солевом растворе Tris-Buffered, TBS.
TBS способствует доступу антител к антигенам, разрывая белковые сшивки. Промойте срез блочным раствором, чтобы уменьшить связывание неспецифических антител. Добавьте в секцию первичные антитела и инкубируйте в течение ночи. Первичное антитело связывается со своим специфическим антигеном, присутствующим на поверхности клетки. Промойте предметное стекло с помощью TBS.
Добавьте конъюгированные с биотином вторичные антитела, которые прикрепляются к Fc-области первичного антитела. Промойте секцию ферментом стрептавидин-биотинпероксидаза. Далее добавьте в ткань хромогенный субстрат пероксидазы. Пероксидаза превращает хромоген в окрашенный нерастворимый продукт.
Противозаправьте ткани раствором гематоксилина. Гематоксилин связывается с кислыми компонентами клеток и окрашивает их в синий цвет. Рассмотрите ткань под световым микроскопом. Антигены обнаруживаются красными, в то время как клетки кажутся синими из-за гематоксилина. В следующем протоколе мы выполним иммуногистохимическое окрашивание для идентификации клеток CD45 и CD1a из эндобронхиальной биопсии.
- Перед тем, как разрезать внедренную биопсийную ткань, осторожно отрегулируйте держатель ножа под углом биопсийного блока так, чтобы лезвие плотно прилегало к поверхности блока. Затем медленно вырежьте не менее двух участков толщиной 2 микрона из каждого образца эндобронхиальной биопсии, используя щипцы для переноса каждого свежевырезанного среза ткани в 0,05% раствор аммиака и дистиллированной воды. Через 45–90 секунд с помощью предметного стекла микроскопа с поли-л-лизиновым покрытием возьмите каждый развернутый срез и дайте им высохнуть в течение как минимум часа.
Когда срезы высохнут, пометьте слайды так, как это подходит для эксперимента, и нарисуйте гидрофобный барьер вокруг каждого образца. Далее нанесите на срезы 1 миллилитр свежеприготовленного раствора блока пероксидазы. Через 30 минут удалите раствор для блокировки пероксидазы, а затем промойте срезы три раза в течение пяти минут TBS, затем удалите TBS и добавьте 1% раствор для блокирования BSA для еще одной 30-минутной инкубации, чтобы блокировать связывание любых неспецифических антител.
В конце инкубации добавьте первичное антитело, разведенное в TBS, и накройте образцы для ночной инкубации при комнатной температуре. На следующее утро трижды промойте предметные стекла в TBS и нанесите вторичное антитело, представляющее интерес, на два часа при комнатной температуре. В конце инкубации предметные стекла еще три раза промыть в свежем TBS и инкубировать образцы в свежеприготовленном комплексном растворе стрептавидин-биотинпероксидазы в течение двух часов при комнатной температуре с последующим еще тремя промывками TBS.
Затем обрабатывайте посуду свежеприготовленным раствором субстрата АЭС-пероксидазы в течение 20-30 минут. Когда разовьется желаемая интенсивность пятна, промойте предметные стекла в проточной водопроводной воде в течение пяти минут и смешайте срезы отфильтрованным раствором гематоксилина Майера. Через две минуты промойте предметные стекла в проточной воде из-под крана еще на пять минут, затем слейте воду и накройте срезы постоянной водной средой для монтажа, высушив образцы в сушильном шкафу при температуре 80 градусов Цельсия.
После того как они остынут, смонтируйте образцы с монтажной средой DPX и защитным колпачком для их анализа с 40-кратным увеличением на световой микроскоп.