Выделение экзосом: метод отделения экзосом из плазмы у пациентов с немелкоклеточным раком легкого

- Экзосомы — это небольшие связанные с мембранами везикулы, несущие биомолекулы, такие как липиды, белки, ДНК, мРНК и микроРНК. Экзосомы высвобождаются различными типами клеток во внеклеточное пространство и могут быть выделены из биожидкостей, таких как плазма.

Для начала центрифугируйте образец плазмы для удаления клеток и мусора. Перенесите надосадочную жидкость плазмы в свежую пробирку. Обработайте плазму ферментом рибонуклеазой в нужной концентрации. Инкубируйте образец на нагревательном блоке при температуре 37 градусов Цельсия в течение соответствующего времени.

Фермент разрушает любую свободную РНК в образце, в то время как экзосомальная РНК остается защищенной. Разбавьте пробу с помощью PBS. Далее добавьте раствор фермента протеиназы К в нужной концентрации и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение соответствующего времени. Протеиназа К разрушает основную массу белков плазмы. Он также инактивирует ранее добавленный фермент рибонуклеазу, тем самым устраняя риск деградации экзосомальной РНК во время последующей обработки.

Добавьте подходящий объем буфера для осаждения экзосом, чтобы облегчить отделение экзосом от плазмы. Центрифугируйте образец для получения гранулы, содержащей неповрежденные экзосомы. Изолированные экзосомы находят применение на последующих этапах, таких как экстракция РНК и белков.

В следующем протоколе мы выполним выделение экзосом из образца плазмы пациентов с немелкоклеточным раком легкого.

- Для начала разморозьте образец плазмы объемом 1 миллилитр на льду. После размораживания переверните трубку несколько раз, чтобы дезагрегировать все криопреципитаты, которые могли образоваться. Затем центрифугируйте плазму при давлении 2000 G в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы удалить клетки и мусор. Соберите надосадочную жидкость и снова центрифугируйте плазму, теперь при 10 000 G в течение 20 минут. Снова соберите надосадочную жидкость плазмы и теперь добавьте 10 микролитров РНКазы. Инкубируйте плазму при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в нагревателе термоблока.

- Мы добавили этап обработки РНКазы в стандартный протокол набора для деградации свободных микроРНК. Позже была использована стадия лечения протеиназой К, включенная в протокол набора, для деградации РНКазы и защиты целостности экзосомальных микроРНК.

- Далее перенесите плазму в новую пробирку с половинным объемом 1x PBS и сделайте ее вихревой. Затем добавьте 0,05 объема раствора протеиназы К, снова перебейте образец в вихрь и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Теперь добавьте 0,2 объема буфера для осаждения экзосом и перемешайте образец путем инверсии. Затем инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут.

После холодной инкубации образец центрифугирует при давлении 10 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Возьмите от 20 до 50 микролитров надосадочной жидкости и храните ее в целях контроля. Затем аспирируйте и выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте гранулу экзосомы в буфере по выбору в объеме, зависящем от последующего анализа. Для анализа РНК добавьте специальный буфер для лизиса для экстракции РНК.