Сравнительный В естественных условиях Изучение иммуногенности gp96 в Лягушка Xenopus laevis

Общая цель данной процедуры заключается в изучении эволюционной сохранности способности белка теплового шока GP96 стимулировать антигенспецифические ответы CD8+ Т-клеток у лягушки Xenopus laevis. Это достигается путем предварительного сбора лейкоцитов брюшины с помощью перитонеального лаважа. Вторым этапом процедуры является пульсация лейкоцитов брюшины GP96, полученным из опухоли, который выступает в роли шаперона минорных и опухолевых антигенов, после проведения инкубации и промывок.

Лейкоциты брюшины переносятся путем внутрибрюшинных инъекций наивным лягушкам для сенсибилизации этих животных к опухолевым или малым антигенам гистосовместимости. Третьим этапом процедуры является пересадка кожи или введение опухолевых клеток сенсибилизированным лягушкам с последующим мониторингом начала отторжения кожного трансплантата или появления опухоли. Заключительным этапом процедуры является забор периферической крови для характеристики T-клеток, участвующих в реакциях отторжения кожи и противоопухолевом ответе.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие значительное ускорение отторжения кожного трансплантата, а также задержку появления опухоли у лягушек, предварительно иммунизированных GP 96, в ходе анализов по пересадке кожи и введению опухолевых клеток соответственно. Здравствуйте, я Кристина Коска из лаборатории доктора Жака Роберта на кафедре микробиологии и иммунологии Медицинского центра Университета Рочестера. Я Таня Круз, также из лаборатории доктора Риверса.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру прайминга клонированных лягушек путем адаптивного переноса лейкоцитов брюшины с последующим проведением тестов по пересадке кожи и трансплантации опухоли. Кроме того, мы покажем, как получить периферическую кровь у этих животных. Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения способности белка теплового шока GP 96 стимулировать антигенспецифические CD4+ T-клетки в Salla, а также для изучения участвующих в этом типов клеток.

Итак, приступим. Лягушки, используемые в наших экспериментах, представляют собой изогенные клоны из нашей разводни в Рочестерском университете. Чтобы вызвать приток лейкоцитов брюшины (PLS) для последующего сбора, используйте иглу калибра 25G длиной 5/8 дюйма для внутрибрюшинного введения обезболенной лягушке препарата из термоинактивированных E. coli. Через три дня после инъекции сбор PLS осуществляют путем внутрибрюшинного лаважа.

Для начала данной процедуры продезинфицируйте брюшную полость анестезированной лягушки небольшим количеством 70% ethanol. Затем с помощью иглы 18 G длиной 1,5 введите пять миллилитров стерильного фосфатно-солевого буферного раствора для амфибий или PBS, предварительно доведенного до комнатной температуры, в брюшную полость. Извлеките иглу и осторожно массируйте лягушку в течение одной минуты, чтобы введенный буфер равномерно распределился в жидкости брюшной полости.

Затем введите в брюшную полость лягушки новую иглу калибра 18 длиной 1.5 без шприца. Избегая повреждения кровеносных сосудов, соберите перитонеальную жидкость, стекающую с тыльной стороны иглы, в чистую коническую пробирку объемом 50 мл. После сбора pls постарайтесь извлечь как можно больший объем изначально введенного раствора.

Поместите лягушку в контейнер с неглубокой водой до ее пробуждения, после чего ее можно вернуть в клетку. После сбора pls центрифугируйте пробу при 1000 RPM в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия, удалите sup, natant и resus. Ресуспендируйте pls в холодном A PBS.

Перенесите РЕСУСПЕНДИРОВАННЫЕ pls в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Для пульсации PLS с помощью GP 96 добавьте соответствующее количество GP 96 к pls и перемешайте путем пипетирования; инкубируйте на льду в течение одного часа, после чего через один час.

Центрифугируйте клетки при 14 000 RPM в течение одной минуты. Для удаления несвязанного GP 96 удалите супернатант. Добавьте холодный A PBS и ресуспендируйте.

Снова центрифугируйте PLS. Промойте S холодным A-P-B-S-A в общей сложности три раза, чтобы убедиться в отсутствии остаточного G 96 после финальной промывки. Ресуспендируйте пульсированные pls в PBS до концентрации 5 × 10⁵ pls на 300 µL для адаптивного переноса pls наивным реципиентам LG six.

Введите внутрибрюшинно по 300 µL пульсированного pls каждому животному. Подготовку лягушек необходимо провести как минимум за три дня до экспериментов по пересадке кожи или введению опухоли, которые будут продемонстрированы далее. Кожу для трансплантации получают от донорской лягушки LG 15, находящейся под наркозом.

С помощью ножниц вырежьте и удалите небольшой фрагмент вентральной кожи — это кожа брюшной стенки, имеющая серебристый оттенок. Из-за наличия ARI четыре пигментированные клетки при работе с трансплантатом. Крайне важно максимально ограничить манипуляции с тканью, так как это может привести к повреждению трансплантата.

Осторожно зажмите кожу пинцетом и поместите ее в чашку Петри с холодным A PBS. Держите чашку Петри на льду. Положите кожу на чистое предметное стекло и с помощью лезвия разрежьте отдельные трансплантаты на фрагменты размером 5 мм на 5 мм.

Храните фрагменты в PBS на льду до момента пересадки кожи на лягушку-реципиента LG six. Сначала сделайте небольшой разрез на дорсальной стороне кожи анестезированного реципиента. Затем введите трансплантат размером 5 мм на 5 мм под кожу серебристой стороной вверх.

Обязательно отметьте следы от ножниц и пинцета на трансплантатах, так как они не считаются признаком отторжения трансплантата. Когда через 24 часа начнется оценка, необходимо удалить часть перекрывающей кожи реципиента с области трансплантата. С помощью ножниц вырежьте «окно» вокруг трансплантата, чтобы обеспечить его свободную визуализацию.

Будьте осторожны, чтобы не коснуться кожи донора и не вызвать кровотечение. Сразу же приступите к разметке трансплантата, сделав набросок. Кожный трансплантат.

Степень отторжения определяется процентом разрушения аридола на пересаженном лоскуте кожи. Состояние трансплантата следует проверять каждые два-три дня с помощью стереомикроскопа. Для трансплантации подготовьте опухолевые клетки, суспендировав их в среде для культивирования опухоли с плотностью 5 × 10⁵ клеток на 300 µL.

Пересадите клетки путем подкожного введения в одну сторону дорсальной области животного. Каждой лягушке вводят 5 × 10⁵ клеток в объеме 300 µL. Рост опухоли начнется в течение двух-трех недель после введения опухолевых клеток.

Отметьте первоначальный вид опухоли. С помощью штангенциркуля измерьте размеры опухоли и фиксируйте ее объем каждые два-три дня до момента забора лейкоцитов крови из лягушки. Подготовьте стеклянные иглы, вытянув паста-пеппес над пламенем.

После заточки тонкого конца пипетки под стереомикроскопом подсоедините пипетку к пластиковой трубке для аспирации. Для начала забора крови сделайте разрез кожи над задней лапой анестезированной лягушки, чтобы обнажить дорсальную вену предплюсны. Заполните стеклянную иглу одним-двумя миллилитрами ледяного раствора PBS с добавлением гепарина.

Затем введите стеклянную иглу в вену и начните сбор крови, медленно аспирируя ее ртом. От одной лягушки среднего размера можно получить от 1 до 2 мл крови. Маленький разрез на лапке лягушки зашивать не нужно.

Рана заживет в течение недели. Здесь представлены результаты стереомикроскопического анализа отторжения кожного трансплантата через 12 дней после трансплантации. У клонированной лягушки LG six, получившей кожный трансплантат от донора LG six с идентичным MHC, отторжения не наблюдалось.

Звездочкой отмечены маркерные щипцы, не сопровождающиеся отторжением. Напротив, у клонированной лягушки LG six, получившей кожный трансплантат от генетически разнородного донора с отличным MHC, наблюдается 80% отторжения. На обоих изображениях стрелками указаны серебристые иридофоры (пигментные клетки), отмечающие здоровую, не отторгнутую трансплантированную ткань.

В следующем эксперименте лейкоциты LG 15 подвергали электропорации либо PBS в качестве отрицательного контроля, либо рекомбинантным GP 96, очищенным из культуры e coli, либо GP 96, очищенным из клеток опухолевой ткани 15 zero. Затем их переносили путем адаптивного переноса взрослым реципиентам LG 15, и через три дня живые опухолевые клетки 15 zero трансплантировали путем подкожной инъекции. Опухоли, впервые появившиеся через несколько дней после введения, мониторили, а размер опухоли измеряли периодически. На этих графиках каждая кривая представляет кинетику роста опухоли у одной лягушки. Результаты показывают, что у животных, сенсибилизированных 0,5 или 1 µg GP 96, появление опухоли было значительно задержано по сравнению с контрольными группами. Следовательно, GP 96 способствует кросс-презентации опухолевых антигенов у xenopus.

Таким образом, мы продемонстрировали способ изучения способности GP 96 представлять как минорные, так и опухолевые антигены у лягушки xap lavis с помощью анализов по пересадке кожи и трансплантации опухоли. При выполнении данной процедуры важно помнить, что следует избегать сбора перитонеального лаважа, если был поврежден кровеносный сосуд, так как большинство клеток в таком случае будут эритроцитами, а не макрофагами. Также важно не сжимать ткань пинцетом при манипуляциях с кожным трансплантатом, чтобы избежать повреждений.

На этом все. Спасибо за промывку и удачи в ваших экспериментах.