ДНК-Stable-Изотопный Зондирование (ДНК-SIP)

Общая цель данной процедуры заключается в выделении ДНК из активных микроорганизмов, которые потребляли интересующий субстрат роста, без необходимости предварительного лабораторного культивирования. Это достигается путем инкубации образца из окружающей среды с субстратом, меченным стабильным изотопом, в условиях, максимально приближенных к естественной среде обитания. Вторым этапом процедуры является экстракция всей ДНК из этого меченного изотопом образца.

На третьем этапе процедуры данную ДНК подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлорида цезия. Заключительным этапом является фракционирование градиента плотности для получения тяжелой и легкой ДНК с целью последующей молекулярной характеристики. В итоге с помощью различных молекулярных методов, включая фингерпринтинг, микрочипирование, гибридизацию, анализ клонов, библиотек и метагеномику, можно определить идентичность активных, но некультивируемых микроорганизмов, участвующих в метаболизме конкретного субстрата.

Здравствуйте, я Джош Нойфелд с кафедры биологии Университета Ватерлоо. Я Эрик Данфорд, аспирант лаборатории Нойфелда. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру изотопного зондирования ДНК, или DNA-SIP, которая стала широко используемым методом для установления связи между идентификацией неизвестных и, возможно, некультивируемых микроорганизмов и их способностью использовать интересующий нас субстрат для роста.

В лаборатории Ньюфельда мы используем данную процедуру для изучения метаболизма источников углерода в различных наземных и водных средах. Сегодня мы продемонстрируем применение конкретного углеродного субстрата — 13 C глюкозы — к образцу почвы. Однако следует отметить, что с момента разработки этого метода группой Колина Мерла в Уорикском университете исследователи адаптировали протокол для применения в самых разных средах, а также с использованием различных меченых изотопов, таких как азот и кислород.

Сегодня мы сосредоточимся на углероде, однако сам протокол может быть применен к различным схемам экспериментов. Итак, приступим. Перед началом данной процедуры подготовьте все реагенты для анализа стабильных изотопов ДНК или DNA CYP, как описано в письменной части данного протокола.

DNAC начинается с инкубации образца. Условия инкубации существенно различаются в зависимости от ряда характеристик образца и субстрата. После эмпирического определения подходящих условий инкубации добавьте соответствующую добавку субстрата в образец из окружающей среды.

Вы также можете добавить дополнительные питательные вещества для обеспечения микробиологического роста, если в этом возникнет необходимость по результатам тестовых инкубаций. После подготовки образца к инкубации закройте его крышкой и герметизируйте, затем инкубируйте environmental samples, содержащие меченый субстрат. В данном примере показано добавление раствора глюкозы, меченной углеродом 13, в образец почвы.

Затем установите контрольную инкубацию для сравнения, чтобы подтвердить наличие метки нуклеиновых кислот, наблюдаемое на последующих этапах. Подготовьте этот образец в идентичных условиях, за исключением использования немаркированного углерода в качестве субстратного колпачка; герметизируйте и инкубируйте образец из окружающей среды с немаркированным субстратом в тех же условиях. После инкубации экстрагируйте ДНК из микрокосмов, используя протокол экстракции, подходящий для предполагаемого дальнейшего анализа. Затем количественно определите содержание экстрагированной ДНК для последующих этапов ультрацентрифугирования с помощью агарозного геля и спектрофотометра.

Для обеспечения максимально возможного разделения легкой и тяжелой ДНК при ультрацентрифугировании используйте вертикальные или почти вертикальные роторы. Ротор Beckman Coulter VTI 65.2 имеет 16 слотов для полимерных пробирок с быстрым запечатыванием объемом 5,1 миллилитра для подготовки образцов к ультрацентрифугированию. Сначала рассчитайте объем экстрагированной ДНК, необходимый для внесения от 0,5 до 5 микрограмм ДНК в пробирки для ультрацентрифугирования.

Используйте ранее определенные концентрации ДНК. Затем с помощью цифрового рефрактометра определите точную плотность основного раствора хлорида цезия. lКак указано в письменном протоколе, рассчитайте объем раствора ДНК в градиентном буфере, необходимый для получения соответствующего соотношения при смешивании.

Используя результаты этих расчетов, смешайте экстрагированную ДНК с градиентным буфером и 4,8 миллилитрами хлорида цезия в стерильной одноразовой пробирке объемом 15 миллилитров. Полученный объем будет превышать заявленную вместимость центрифужных пробирок, чтобы полностью заполнить их. В завершение перемешайте раствор, 10 раз перевернув пробирку, в соответствии с вариантами данного протокола.

Используйте флуоресцентный краситель, такой как акридиновый оранжевый и бромистый этидий, в составе градиентного раствора, чтобы визуализировать ДНК внутри пробирки. Изменение плотности ДНК при подготовке с использованием ДНК из чистой культуры, включая градиент с бромистым этидием, как показано здесь, особенно полезно для немедленного визуального подтверждения формирования градиента после каждого центрифугирования. Этапы выполнения данного подхода описаны в письменном протоколе.

Для подготовки к ультрацентрифугированию сначала с помощью резиновой груши и пастеurizedной пипетки осторожно заполните пробирки для ультрацентрифуги растворами градиента. Маркируйте пробирки на плечике тонким перманентным маркером. Убедитесь, что пробирки заполнены точно до основания горлышка, так как недостаточно заполненные пробирки имеют тенденцию разрываться во время ультрацентрифугирования.

После заполнения всех необходимых пробирок растворами образцов зафиксируйте точную массу каждой пробирки. Распределите пробирки по парам с максимально близким весом, добавляя или удаляя небольшие количества раствора до тех пор, пока разница между ними не составит не более 10 milligrams. Старайтесь поддерживать уровень раствора максимально близким к основанию пробирки. Затем герметично закройте пробирки с помощью заглушек в соответствии с инструкциями производителя.

Убедитесь, что пробирки герметично закрыты, перевернув их и приложив умеренное давление. Взвесьте пробирки повторно, чтобы убедиться, что после герметизации перед ультрацентрифугированием они остаются сбалансированными. Тщательно осмотрите каждое гнездо ротора, чтобы убедиться в их чистоте и отсутствии пыли или посторонних частиц, которые могли бы проколоть пробирки во время ультрацентрифугирования.

Поместите пробирки в ротор, располагая сбалансированные пары друг напротив друга. Запишите положение каждой пробы в роторе, так как в процессе ультрацентрифугирования маркерные метки могут стать нечитаемыми. Тщательно загерметизируйте лунки ротора в соответствии с указаниями производителя.

После герметизации лунок ротора установите ротор в ультрацентрифугу. Закройте дверь ультрацентрифуги и создайте вакуум для ротора VTI 65.2. Установите скорость вращения на 44 100 RPM, температуру на 20 °C и время ультрацентрифугирования от 36 до 40 часов.

Убедитесь, что вакуум включен, выберите максимальное ускорение и отключите торможение, чтобы замедление не нарушило градиент. Сразу после ультрацентрифугирования осторожно извлеките ротор. Будьте осторожны, не наклоняйте и не ударяйте ротор, чтобы не нарушить градиенты в пробирках.

Наконец, осторожно извлеките пробирки для градиентного фракционирования. ДНК можно выделить из ультрацентрифужных пробирок с помощью метода фракционирования. Для начала наполните стерильный шприц объемом 60 миллилитров стерильной дистиллированной и деионизированной водой, содержащей достаточное количество красителя пропофол блю.

Для получения темно-синего цвета установите шприц в зажим шприцевого насоса. Затем подсоедините трубку насоса, оснащенную иглой 23G длиной один дюйм, и включите насос, пока вода не начнет поступать из кончика иглы. Избегайте появления пузырьков воздуха в подаче воды, так как они отрицательно повлияют на процесс фракционирования.

Для каждого образца подготовьте 12 стерильных микроцентрифужных пробирок объемом 1.5 миллилитра с этикетками, на которых указаны номер образца и фракция. Затем зафиксируйте одну из пробирок для ультрацентрифугирования в штативе-зажиме быстрым и контролируемым движением. Проколите дно пробирки вдоль шва, используя новую иглу калибра 23 длиной один дюйм, и прокрутите иглу, чтобы обеспечить формирование однородного отверстия.

Возможно, вы заметите, что латексные перчатки обеспечивают лучший захват стержня иглы, чем нитриловые. Используя иглу, прикрепленную к трубке насоса, быстрым и контролируемым движением проколите верхнюю часть трубки в области верхнего плеча вдоль шва. Обратите внимание, что также допустимо сначала проколоть верхнюю, а затем нижнюю часть трубки.

Также следует отметить, что небольшое количество минерального масла, нанесенное на плечики пробирки, может помочь предотвратить утечку из-за неплотного прилегания верхней иглы при ранее откалиброванной скорости насоса. Перекачайте окрашенную воду в верхнюю часть пробирки так, чтобы за 12 минут получить 12 фракций объемом 425 microliter. Используйте таймер для сбора градиентного раствора в промаркированные микроцентрифужные пробирки.

Наконец, проверьте плотность всех фракций как минимум для одного образца или контрольного градиента с помощью цифрового рефрактометра. Ожидаемые значения должны находиться в диапазоне от 1.690 до 1.760 г/мл со средней плотностью примерно 1.725 г/мл для осаждения ДНК из всех фракций.

Сначала добавьте 20 µg линейного полиакриламида в качестве носителя для осаждения и перемешайте путем инверсии. Затем добавьте два объема раствора ПЭГ и снова перемешайте путем инверсии. Оставьте пробирки при комнатной температуре на два часа для осаждения ДНК после инкубации.

Поместите образцы в микроцентрифугу, ориентировав пробирки в одном направлении для обеспечения единообразного расположения осадка после центрифугирования. Центрифугируйте пробирки при 13,000 G в течение 30 минут, затем извлеките образцы из микроцентрифуги, осторожно аспирируйте и удалите супернатант. На данном этапе осадок должен быть виден при использовании яркого источника света.

После центрифугирования промойте осадок 500 µL 70% этанола. Центрифугируйте образцы при 13 000 G в течение 10 минут, после чего осторожно аспирируйте и удалите супернатант. Теперь осадок станет более заметным, но будет легче отделяться от стенки пробирки.

Дайте осадку высохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут. После высыхания осадка суспендируйте каждый осадок в 50 µL ТЕ-буфера. Наконец, нанесите по 5 µL каждой фракции на аэрозольный гель для характеристики фракций градиента с использованием методов, описанных в письменном протоколе.

Типичные результаты ДНК-SIP демонстрируют разделение меченой и немеченой ДНК в градиенте путем ультрацентрифугирования. В идеале должно наблюдаться полное разрешение высокомолекулярного генетического материала, например, меченого углеродом 13 и азотом 15, от немеченого материала; в частности, уникальные ПЦР-фингерпринты, связанные с фракциями с четвертой по восьмую образцов, инкубированных со стабильными изотопами, но отсутствующие в образцах с нативным субстратом. Контроли инкубации предоставляют веские доказательства связи конкретных организмов с метаболизмом определенного меченого субстрата: при анализе ДНК двух чистых культур — штамма Methylococcus capsulatus bath, меченого углеродом 13, и немеченого S. mediam ATCC 1021 — меченая и немеченая геномная ДНК разделяются по соответствующим фракциям градиента с разной плотностью.

В данном примере ДНК, меченная тяжелыми изотопами, наблюдается в фракциях с четвертой по пятую, тогда как немеченая ДНК обнаруживается в высоких концентрациях во фракциях с девятой по десятую. ПЦР-амплифицированная ДНК из тех же фракций была разделена с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE), в результате чего образовались дискретные полосы, соответствующие двум организмам, включенным в градиент. Плотность фракций варьируется примерно от 1,580 до 1,759 г/мл; они представлены в порядке убывания плотности слева направо.

Напротив, интерпретация результатов разделения изотопов и инкубации проб из окружающей среды может быть более сложной. Почвы тундры из залива Резолют, Канада, инкубировали с глюкозой, меченной либо углеродом 12, либо углеродом 13, в течение 14 дней при 15 °C. Аэрогели очищенной фракции ДНК градиента выявили размытое распределение геномной ДНК в фракциях с 7 по 10 как для инкубаций с углеродом 12, так и с углеродом 13.

Однако при использовании DGGE генов 16S рРНК для определения обогащения биомассы конкретных микробных таксонов углеродом 13, почва, инкубированная с глюкозой с углеродом 12, показала схожие паттерны ДНК во всех фракциях градиента, в то время как образец, инкубированный с глюкозой с углеродом 13, дал профили DGGE, которые уникально связаны с фракциями с пятой по восьмую; консервативные полосы, отмеченные стрелками, представляли доминирующий филотипический состав, который был неизменным во всех фракциях градиента. Филотипы смещаются в сторону более тяжелых фракций для ДНК, полученной из почвы, инкубированной с глюкозой с углеродом 13. Идентификация этого конкретного гена 16S рРНК может быть определена для дальнейшего применения метагеномных методов или подходов, основанных на культивировании.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить эксперимент по стабильному изотопному зондированию ДНК — от инкубации образцов до получения меченой ДНК для молекулярного анализа. При выполнении этой процедуры важно тщательно продумать план эксперимента; будьте осторожны и не добавляйте слишком много субстрата, чтобы избежать смещения результатов в сторону быстрорастущих организмов. Также следует избегать длительной инкубации, чтобы субстрат не распределился между другими членами сообщества через пищевую сеть.

Таким образом, используя точно отмеренное количество субстрата и достаточное время инкубации, вы сможете обнаружить небольшие количества меченной ДНК в тяжелых фракциях с помощью высокочувствительных методов ПЦР. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.