Микродиссекции данио рерио эмбриональных тканей глаз

В данном видео демонстрируется микродиссекция сетчатки, а также сетчатки с прикрепленным ретинальным пигментным эпителием (РПЭ) эмбрионов zebrafish на стадии от одного до трех дней после оплодотворения. Все процедуры можно выполнить с помощью тонких пинцетов и стандартного лабораторного оборудования. При проведении диссекции сетчатки под обычным стереомикроскопом однослойный РПЭ удаляется путем аккуратного смещения и за счет прилипания РПЭ к поверхности культуральной чашки.

Для проведения диссекции сетчатки, прикрепленной к РПЭ, перед началом процедуры адгезивные свойства культуральной пластины устраняются путем механического раздавливания эмбриона и промывки. Чтобы сохранить РПЭ целым, аккуратное приподнимание этой ткани позволяет эффективно отделить хориоидею и склеру от прикрепленной к РПЭ сетчатки, после чего линза удаляется с помощью химически травленой вольфрамовой иглы. Данный метод диссекции позволяет получить интактные ткани сетчатки и был успешно использован для изучения тканеспецифичной экспрессии РНК, а также профилей сетчатки и ретинального пигментного эпителия у данио-рерио.

Здравствуйте, я Ли Джанг из лаборатории профессора УФЕ Леона на кафедре биологических наук Университета Пердью. Сегодня мы покажем вам, как проводить диссекцию тканей эмбрионального глаза рыбки-зебра. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения генной сети, регулирующей развитие глаза.

Итак, приступим. Восьмое. Перед началом микродиссекции приготовьте следующие растворы: E3, фильтрованную стерильную раствор Рингера и 5Н гидроксид натрия.

Затем проведите химическое травление вольфрамовых игл. Установите небольшой стакан в чашку Петри, зафиксировав его глиной для удобства обращения со стаканом и предотвращения разлива гидроксида натрия. Прикрепите обычную канцелярскую скрепку к стенке стакана.

Налейте в стакан 5 N раствор гидроксида натрия до тех пор, пока скрепка не окажется погруженной в раствор. Подключите отрицательный электрод источника постоянного тока к канцелярской скрепке, а положительный электрод — к одному концу короткого отрезка вольфрамовой проволоки. Оберните другой конец вольфрамовой проволоки глиняным шариком диаметром 4 мм и погрузите этот конец в раствор гидроксида натрия.

Увеличьте напряжение примерно до трех вольт и в течение одной секунды перемещайте проволоку вверх и вниз с интервалами в растворе гидроксида натрия на протяжении около 10 минут. Вольфрамовая проволока, подвергающаяся воздействию гидроксида натрия, будет постепенно истончаться, в то время как часть проволоки с другой стороны глиняного шарика, прикрепленная к положительному электроду, приобретет форму острой иглы. Промойте острую иглу раствором Рингера или E3 для удаления солевых отложений и закрепите иглу на деревянном аппликаторе с помощью скотча или держателя для игл для удобства манипуляций при подготовке эмбрионов к диссекции.

За ночь до разведения содержите взрослых особей super fish в соответствии со стандартными протоколами. Разделите родительских рыб по парам в статических нерестовых аквариумах с помощью перегородки. Следующим утром, после включения света в помещении, уберите перегородку и позвольте родителям скрещиваться интервалами по 10 минут каждые полчаса, разделяя рыб после каждого скрещивания.

Поддерживайте эмбрионы, собранные после каждого скрещивания, раздельно в среде E three при температуре 28 °C. Определяйте стадию развития эмбрионов через 10–12 часов после оплодотворения и повторно определите стадию непосредственно перед диссекцией в указанные временные точки. Для диссекции используйте полистирольные культуральные планшеты Falcon 60 × 15 мм.

Новая неиспользованная планшетная подложка обладает естественным адгезивным свойством по отношению к ткани РПЭ в течение примерно 20 минут, что может облегчить удаление РПЭ при диссекции сетчатки. Если требуется сохранить сетчатку с прикрепленным РПЭ, это адгезивное свойство можно нейтрализовать, полностью раздавив два эмбриона в культуральной чашке с раствором Рингера и выдержав их в течение 30 минут перед диссекцией, с последующей тщательной промывкой свежим раствором Рингера перед началом процедуры. Все тонкие диссекции проводятся при увеличении примерно в 5–8 раз на микроскопе Olympus SC X 16 с использованием объектива 1x.

Используя пинцет Dumont или химически вытравленную вольфрамовую иглу, нагрейте предметный столик микроскопа до 28 °C. Чтобы минимизировать влияние температурных колебаний при начале диссекции сетчатки, перенесите эмбрион на определенной стадии развития в 5 mL раствора Рингера в культуральную чашку Falcon размером 60 × 15 мм, подготовленную согласно описанию для диссекции сетчатки без RRPE; с помощью острого кончика пинцета быстро отсеките голову и часть переднего отдела туловища, удалив тело зебрафиш. Затем зафиксируйте задний конец отделяемого сегмента головы и туловища на культуральной чашке с помощью булавок. С помощью вспомогательного пинцета вскройте голову с дорсальной стороны, начиная от передней части лба.

Удалите мозг таким образом, чтобы медиальная сторона глаз была открыта и обращена вверх для дальнейших манипуляций. Для диссекции сетчатки используйте кончик пинцета, чтобы осторожно сдвинуть обнаженный РПЭ на медиальной стороне глаза, обращенного вверх, до появления небольшого отверстия в сетчатке. Продолжайте сдвигать и отделять ткань до тех пор, пока медиальная сторона сетчатки не будет практически полностью обнажена.

При удалении латерального РПЭ на сетчатке глаза, обращенного к чашке для культивирования, избегайте царапать или прокалывать обнаженную сетчатку. Расположите глаз под углом примерно 45 градусов к поверхности планшета для культивирования и аккуратно сдвиньте его пинцетом. Удалите РПЭ, который относительно плотно прикреплен к zora serrata, закрепив отделенную часть РПЭ на планшете для культивирования для проведения диссекции.

Затем осторожно приподнимите сетчатку, чтобы удалить остатки РПЭ, и извлеките хрусталик, используя адгезионные свойства чашки для культивирования. Будьте осторожны, чтобы не повредить клетки сетчатки, которые также будут частично прилегать к поверхности чашки. Если хрусталик не отделяется при перекатывании, используйте травленую вольфрамовую иглу, совершая вращательные движения по поверхности хрусталика.

Для начала диссекции сетчатки с прикрепленным RPE используйте культуральную пластину Falcon размером 60 x 15 миллиметров, подготовленную согласно описанию для диссекции сетчатки с прикрепленным RPE. Перенесите эмбрион на определенной стадии развития в 5 мл раствора Рингера. Отрежьте голову и часть переднего отдела туловища.

Быстро удалите тело зебранио (zebrafish), как было сделано ранее. Закрепите задний конец отдела головы и туловища на культуральной чашке. С помощью вспомогательного пинцета раскройте голову с дорсальной стороны, начиная от передней части лба.

Удалите мозг таким образом, чтобы медиальная сторона глаз была обнажена и обращена вверх. Для дальнейших манипуляций с помощью пинцета осторожно приподнимите глаз с заднебоковой стороны и перекатите его к передней стороне. Ткань хориоидеи и склеры, находящаяся снаружи слоя РПЭ, прикреплена достаточно плотно к коже; ее можно в основном отделить, осторожно перекатывая глаз к передней стороне.

Удалите хрусталик с помощью вольфрамовой иглы после обнажения латеральной стороны глаза, пока глаз всё еще прикреплен к коже для диссекции сетчатки. При отсутствии РПЭ (ретинального пигментного эпителия) и прикрепленной к нему сетчатки диссекированные образцы можно собрать в раствор триола в микроцентрифужную пробирку для РНК с целью последующего анализа РНК.

Здесь показана успешная диссекция сетчатки без РПЭ, при которой целостность сетчатки сохранена, о чем свидетельствует неповрежденная поверхность сетчатки. Соответствующий гистологический срез также показывает, что архитектура сетчатки очень хорошо сохранена. В частности, исключительно хорошо сохранена внеклеточный матрикс между слоем фоторецепторов и РПЭ.

Успешная диссекция сетчатки с сохранением прикрепленного слоя RPE характеризуется целостностью и непрерывностью слоя RPE. Соответствующий гистологический срез показывает, что клетки как сетчатки, так и RPE находятся в хорошем состоянии. Общая РНК, экстрагированная из диссекированных сетчаток, обладает высоким качеством.

Об этом свидетельствуют электрофореграмма и изображение геля, полученные в результате анализа на биоанализаторе. Базовая линия ровная, а рибосомальные пики 18 s и 28 s сохранены. Индекс целостности РНК обычно превышает 9.8.

Мы только что продемонстрировали процедуры микродиссекции для получения эмбриональной сетчатки рыбки-зебра с ПЭС и без неё. При выполнении данной процедуры важно помнить, что наиболее критическими этапами диссекции сетчатки являются выметающие движения кончиком пинцетов и скатывание ткани. Мы обнаружили, что при удалении остатков ПЭС использование регулируемых подлокотников вашего кресла во время диссекции может существенно стабилизировать движения рук.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.