Электропорация органоидов: метод трансфекции плазмидной ДНК в органоиды желудочно-кишечного тракта

- Органоиды — это крошечные трехмерные клеточные культуры, полученные из тканеспецифических стволовых клеток. Они геномно стабильны, но генетически модифицируются путем трансфекции и, таким образом, идеально подходят для генетических исследований. Для трансфекции органоиды засеивают в многолуночную культуральную тарелку с определенной питательной средой и инкубируют в течение желаемой продолжительности. Затем добавьте на пластину смесь для диссоциации, чтобы помочь диссоциации органоидных клеток. Переложите смесь в пробирку и центрифугу. Ресуспендируйте органоидную гранулу в буфере для электропорации, содержащем флуоресцентно меченую плазмидную ДНК. Буфер стабилизирует клетки и предотвращает их гибель из-за электрического напряжения.

Переложите смесь в кювету и электропорируйте ячейки. Электрические импульсы через клеточную мембрану приводят к временному образованию пор, что способствует поглощению плазмидной ДНК в клетку. После электропорации немедленно добавьте питательную среду в клеточную суспензию и переложите смесь в пробирку. Теперь центрифугируем ячейки. Повторно суспендируйте гранулу в матрице основания и перенесите в многолуночную пластину для полимеризации. Поместите планшет под флуоресцентный микроскоп и проверьте наличие флуоресценции в клетках, что подтверждает эффективность трансфекции. В следующем протоколе мы проведем электропорацию для трансфекции органоидов желудочно-кишечного тракта.

- Начните с предварительного нагрева 48-луночных планшетов при температуре 37 градусов Цельсия для посева после электропорации, затем подготовьте базальные и органоидные среды, специфичные для культуры, в соответствии с указаниями рукописи. Обработайте пять лунок органоидов на каждый образец электропорации в 48-луночном планшете. Приготовьте 230 микролитров диссоциационного реагента с 10 микромолярами Y27632 на лунку. Наблюдайте за органоидами под микроскопом. Извлеките питательную среду из лунок и диссоциируйте органоиды механическим способом в приготовленной диссоциационной смеси. Объедините пять лунок на образец электропорации в одну 15-миллилитровую пробирку.

Перемешайте содержимое пробирки с помощью вортекса и инкубируйте ее в течение 5-15 минут при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не образуются кластеры от 10 до 15 клеток, проверяя диссоциацию с помощью микроскопа. Остановите пищеварение, добавив до 10 миллилитров базальной среды без антибиотиков. Центрифугируйте пробирку при 450 умноженных на g в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте клетки 4 миллилитрами электропориционного буфера. Центрифугируйте и выбрасывайте надосадочную жидкость после каждой стирки. После промывки ресуспендируйте органоидную гранулу в 100 микролитрах электропорационного буфера с 30 микрограммами плазмидной ДНК.

Диспонируйте полную смесь ДНК-органоидов в кювету для электропорации. Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. Установите параметры электропорации, как описано в текстовой рукописи, и постучите пальцем по кювете, чтобы аккуратно перемешать клетки. Поместите кювету в камеру кюветы и нажмите кнопку импеданса на электропораторе, чтобы записать значение импеданса. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить программу электропорации и управлять значениями отображаемых токов, напряжений и энергий.

После электропорации немедленно добавьте в клетки 500 микролитров питательной среды без антибиотиков и перемешайте пипетированием вверх и вниз. Переложите образец в новую 15-миллилитровую пробирку и промойте кювету базальной средой, чтобы собрать оставшиеся клетки, затем инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 40 минут. Центрифугируйте клетки при 450 умноженных на g в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 100 микролитров базовой матрицы и засейте по 20 микролитров капель в предварительно прогретую 48-луночную пластину.

Инкубируйте планшет в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия для полимеризации и добавьте 250 микролитров питательной среды с добавлением Y27632 и CHIR-99021 в лунку. Чтобы определить эффективность трансфекции, проверьте флуоресценцию в трансфекционном контроле под микроскопом через 24-48 часов.