Стимуляция Т-клеток ex vivo при опухоли поджелудочной железы: метод увеличения продукции цитокинов в Т-клетках

- Активированные Т-клетки перемещаются в микроокружение опухоли поджелудочной железы, где они высвобождают цитокины, такие как интерферон-гамма, или ИФН гамма, и фактор некроза опухоли-альфа, или ФНО-альфа, который помогает опосредовать эффективный противоопухолевый ответ. Поскольку цитокины быстро выходят из Т-клеток, внутриклеточные уровни могут быть неопределяемыми. Таким образом, Т-клеткам требуется стимуляция для увеличения продукции базальных цитокинов для изучения их терапевтической роли в опухоли.

Начните со взятия суспензии опухолевых клеток из поджелудочной железы мыши. Теперь обработайте Т-клетки, присутствующие в клеточной суспензии, коктейлем для стимуляции цитокинов и инкубируйте смесь в течение желаемого времени. Этот коктейль способствует высвобождению ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму. Высокий уровень кальция, в свою очередь, активирует определенные ядерные факторы транскрипции, что приводит к увеличению выработки цитокинов в Т-клетках.

Затем обработайте клетки коктейлем из ингибиторов транспорта белка и инкубируйте трубку. Этот коктейль блокирует транспорт цитокинов из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, что приводит к накоплению цитокинов в клетке. Наконец, окрашивают клетки с помощью соответствующих внутриклеточных маркеров для анализа проточной цитометрии. В следующем протоколе мы проведем стимуляцию Т-клеток для повышения внутриклеточной концентрации цитокинов.

- Для начала с помощью щипцов перенесите опухоль на чашку Петри. Храните 5 миллилитров пищеварительной среды в 50-миллилитровой пробирке на льду, чтобы предотвратить начало активности ферментов. Возьмите небольшую аликвоту этого раствора, чтобы покрыть опухоль на чашке Петри. С помощью стерильного скальпеля и щипцов разрежьте опухоль на мелкие кусочки, примерно менее 3 миллиметров в длину. Соскребите кусочки опухоли в пробирку и аккуратно переверните пробирку, пока все части не будут погружены в среду для пищеварения. Перенесите трубку на устройство для встряхивания на 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия для переваривания. Убедитесь, что все части опухоли погружены в воду и не прилипают к краю трубки.

Сразу после этапа пищеварения поместите трубку на лед, чтобы замедлить активность ферментов. Добавьте ЭДТА для достижения конечной концентрации 20 миллимоляров и кратковременно перемешайте образец для смешивания, чтобы еще больше замедлить активность ферментов. Откройте пробирку и смойте остатки опухоли с крышки пробирки свежей средой RPMI. Затем приготовьте ситечко толщиной 70 микрон. Поместите его на 50-миллилитровую открытую тубу со льдом. Предварительно смочите фильтр средой. Повторно суспензируйте переваренные клетки и промойте боковые стороны трубки с помощью полоски объемом 25 миллилитров или больше. Более широкое отверстие полоски позволяет густому диджесту легко проходить.

Переложите весь диджест на ситечко с помощью 25-миллилитровой полоски. Разомните опухоль вверх и вниз поверх фильтра с помощью 1-миллилитрового шприца-поршня. Непрерывно промывайте ячейки через сетчатое фильтр с помощью RPMI. Убедитесь, что вы моете с достаточным усилием, чтобы протолкнуть ячейки. Продолжайте мытье, пока все ячейки не пройдут через ситечко. Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 300 умноженных на g и 4 градусах Цельсия.

Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу и завершите RPMI, а затем пропустите непосредственно через другой фильтр, чтобы удалить любой внеклеточный матрикс или крупные клеточные скопления, которые не могут быть адекватно ресуспендированы. Если стимуляция не требуется, выделенные клетки немедленно окрашивают для анализа проточной цитометрией или ресуспендируют в замораживающую среду с концентрацией 10% ДМСО в FBS и хранят при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы провести стимуляцию, сначала посчитайте клетки. Развести клетки в полной среде до концентрации от 2 до 10 до 6 на 100 мкл. Планшет 100 микролитров ячеек в каждой лунке с U-образным дном 96-луночного планшета. Добавьте 100 микролитров готовой среды, содержащей 2-кратный препарат PMA и иономицина. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на один час. Затем добавьте 20 микролитров 10-кратного препарата Брефельдина-А и Монензина и готовую среду для достижения конечной концентрации 1,06 микромоляра и 2,0 микромоляра соответственно. Поставьте тарелку обратно в инкубатор еще на четыре часа.