Выделение первичных ацинарных клеток: метод выделения ацинарных клеток из поджелудочной железы мыши

- Ацинарная клетка поджелудочной железы — это экзокринная клетка, содержащая различные пищеварительные ферменты. Иногда, в ответ на онкогенную сигнализацию, ацинарная клетка превращается в протоковую клетку. Эта протоковая клетка впоследствии может стать раковой. Поэтому жизненно важно изолировать ацинарные клетки, чтобы изучить их роль в прогрессировании рака поджелудочной железы.

Начните с изоляции поджелудочной железы от усыпленной мыши. Добавьте поджелудочную железу в весовую лодку, содержащую сбалансированный раствор соли, дополненный антибиотиком. Измельчите поджелудочную железу на мелкие кусочки с помощью ножниц и добавьте ткань поджелудочной железы в трубочку. Далее добавьте раствор коллагеназы на кусочки поджелудочной железы в трубку.

Коллагеназа переваривает коллаген, который удерживает ткань вместе, так что ткань распадается на мелкие кусочки. Теперь добавьте в пробирку питательную среду, содержащую сыворотку, и положите салфетку на лед. Это способствует остановке действия коллагеназы.

Отфильтруйте ткань и фильтрующий материал дважды, каждый раз постепенно уменьшая размер ячеек фильтра, чтобы получить тонкую тканевую суспензию. Наконец, центрифугируйте полученную суспензию для сбора ацинарных клеток в грануле. Удалите надосадочную жидкость и сохраните ацинарные клетки для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы выделим ацинарные клетки из поджелудочной железы усыпленной мыши.

- Чтобы рассечь поджелудочную железу у усыпленной мыши, сначала приколите лапы мыши к крышке из полистирола, ориентируя ее так, чтобы хвост был обращен к исследователю, и опрыскайте брюшную полость 70% этанолом. С помощью автоклавных щипцов поднимите шерсть и кожу по средней линии, а автоклавными ножницами сделайте разрез через шерсть и кожу от отверстия уретры до области диафрагмы и грудной клетки. Сделайте дополнительные надрезы слева и справа, чтобы срезать шерсть и кожу, создав четкий обзор брюшной полости.

Затем врежьте в брюшину слизистую оболочку посередине и справа и слева, и оттяните ее от органов. Используйте щипцы, чтобы поднять кишечник и переместить его на левую сторону мыши, создавая пространство для обзора светло-розовой поджелудочной железы, прикрепленной к темно-красной овальной селезенке. Ткань поджелудочной железы будет иметь мягкую, губчатую текстуру. Вырезаем поджелудочную железу, которая проходит вдоль желудка, переплетаясь с кишечником.

Отделите селезенку от поджелудочной железы и поместите поджелудочную железу в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров HBSS с 1X пенициллин-стрептомицином, и перенесите ее в колпак ламинарного потока. Вылейте содержимое трубки в пустую лодку для взвешивания и с помощью щипцов промойте поджелудочную железу, поворачивая ее. Затем с помощью щипцов переместите поджелудочную железу во вторую весовую лодку, содержащую HBSS с пенициллин-стрептомицином, и снова промойте путем закручивания.

Переместите поджелудочную железу на третью весовую лодку, содержащую HBSS с пенициллин-стрептомицином, и начните разрезать поджелудочную железу на 5-миллиметровые или более мелкие кусочки. Чтобы вылить содержимое весовой лодки в свежую 50-миллилитровую трубку, сначала с помощью щипцов переместите кусочки поджелудочной железы в жидкость во время опрокидывания лодки. Как только детали больше не будут прикреплены к лодке, вылейте ее содержимое в трубку. Соберите все оставшиеся части с помощью щипцов и промойте щипцы в трубке.

После центрифугирования пробирки при 931-кратном течении силы тяжести при 4 градусах Цельсия в течение двух минут используйте 5-миллилитровую пипетку для удаления HBSS и любого плавающего жира. Добавьте 5 миллилитров коллагеназы, разведенной в HBSS. Закройте трубку и убедитесь в герметичной крышке, обернув трубку пластиковой парафиновой пленкой. Поместите его в инкубатор, встряхивая со скоростью 220 оборотов в минуту при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут, что даст мутный раствор и несколько оставшихся кусочков ткани.

Чтобы остановить диссоциацию, поместите трубку на лед и добавьте 5 миллилитров холодного HBSS с 5% FBS. После центрифугирования при 931-кратной плотности при 4 градусах Цельсия в течение двух минут удалите надосадочную жидкость с помощью 5-миллилитровой пипетки. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах HBSS с 5% FBS и снова центрифугируйте при 931-кратной плотности в течение двух минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость с помощью 5-миллилитровой пипетки и повторите этот шаг с еще 10 миллилитрами HBSS с 5% FBS. Затем повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах HBSS с 5% FBS. С помощью пипетки P1000 фильтруйте клеточную суспензию по 1 миллилитру за раз через ячейку толщиной 500 микрометров в 50-миллилитровую пробирку.

Чтобы промыть оставшиеся клетки поджелудочной железы через сетку, добавьте еще 5 миллилитров HBSS с 5% FBS. Затем с помощью пипетки P1000 этот фильтрат пропускает 1 миллилитр за раз через 105-микрометровую ячейку в 50-миллилитровую трубку. Аккуратно пипетируйте эту клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку, содержащую HBSS с 30% FBS, которая образует слой клеточной суспензии сверху.

Центрифугируйте эту суспензию элемента при 233-кратном весе силы тяжести при 4 градусах Цельсия в течение двух минут и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу, содержащую ацинарные клетки, в полной среде 1X Waymouth.