Выделение островков поджелудочной железы с помощью перфузии коллагеназы: ферментативный метод выделения островковых клеток поджелудочной железы

- Островковые клетки поджелудочной железы вырабатывают необходимые гормоны, участвующие в эндокринных функциях. Чтобы изолировать островки, сначала обезопасьте усыпленную мышь и хирургическим путем обнажите ее брюшную полость. Отведите в сторону печень и кишечник, чтобы найти и пережать общий желчный проток. Определите ампулу Фатера, протока, образованного слиянием поджелудочной железы и общих желчных протоков.

Далее введите раствор фермента коллагеназы в общий желчный проток. Обратный поток из протока успешно раздувает поджелудочную железу, способствуя индуцированной коллагеназой диссоциации тканей поджелудочной железы. Исрежьте поджелудочную железу в пробирку, содержащую больше раствора коллагеназы. Механически измельчите ткань и инкубируйте, чтобы помочь перевариванию тканей коллагеназой.

После получения однородной суспензии следует остановить ферментативное расщепление, добавив раствор, содержащий белки, ингибирующие активность коллагеназы. Центрифуга для сбора тканевых гранул. Повторно суспендируйте гранулу в среде с соответствующим градиентом плотности, нанесите на нее слой подходящего буфера и центрифугируйте для получения градиентных слоев.

Соберите островки из слоя, образованного между градиентом плотности среды и буфером. Наконец, выберите здоровые островки для культивирования. В следующем протоколе мы продемонстрируем выделение островков поджелудочной железы у мышей путем введения коллагеназы с последующим центрифугированием с градиентом плотности.

- Начните с тейпирования конечностей мыши в положении лежа на спине и распылите на тело 70% этанола. С помощью покровных щипцов и изогнутых хирургических ножниц сделайте горизонтальный разрез кожи живота размером примерно 3 сантиметра и растяните кожу, чтобы обнажить брюшную стенку. Сделайте вертикальный разрез размером от 3 до 4 сантиметров на брюшной брюшине, чтобы полностью обнажить поджелудочную железу, и поместите мышь под препарирующий микроскоп.

Надавите на долю печени вверх, чтобы обнажить желчный проток, который выглядит как бледно-розовая трубка, и осторожно переместите кишечник из правой поясничной и подвздошной области вправо от брюшной полости, чтобы обнажить желчный проток и печеночную артерию. Используйте Schwartz Micro Serrefines, чтобы аккуратно пережать общий желчный проток как можно ближе к печени и определить ампулу Фатера, которая расположена в дуоденальном сосочке и образована слиянием протока поджелудочной железы и общего желчного протока.

С помощью щипцов Micro Adson для натягивания общего желчного протока введите полудюймовую иглу 30-го калибра, прикрепленную к 3-миллилитровому шприцу, содержащему 3 миллилитра свежеприготовленного раствора коллагеназы Р, в ампулу Фатера, протолкнув иглу в проток параллельно сосуду примерно на четверть длины сосуда. Как только игла будет на месте, стабилизируйте иглу щипцами Micro Adson и медленно и неуклонно вводите в проток 3 миллилитра раствора коллагеназы P. Инъекция считается успешной, если головка, шея, тело и хвостовые отделы поджелудочной железы полностью надуты.

- Правильное поступление в ампулу и канюляция общего желчного протока имеют решающее значение для успешного сбора пищеварения. Прокалывание стенок протоков снижает эффективность изоляции.

- С помощью изогнутых щипцов и щипцов Micro Adson осторожно вытяните надутую поджелудочную железу, начиная с селезенки и продолжая по направлению к животу и вдоль двенадцатиперстной кишки. Затем поместите поджелудочную железу в 50-миллилитровую пробирку для пищеварения, содержащую 3 миллилитра ледяного раствора коллагеназы P. Чтобы собрать островки, сначала с помощью тонких хирургических ножниц измельчите поджелудочную железу в течение 3-5 секунд, а затем поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью от 100 до 120 оборотов в минуту на 12-13 минут.

В конце инкубации осторожно встряхните пробирку в течение примерно 30 секунд, чтобы разрушить ткань до тех пор, пока раствор не станет однородным, что подтверждается мелкими, похожими на песок частицами ткани поджелудочной железы. Как только ткань переварится, поместите трубку на лед и добавьте 40 миллилитров ледяного раствора для остановки, чтобы завершить ферментативную реакцию. После осторожного разрушения гранул раскрутите пищеварительную ткань в центрифуге с качающимся ведром, а затем дважды центрифугируйте с 20 миллилитрами свежего раствора на промывку.

После последней промывки повторно суспендируйте гранулу в 40 миллилитрах ледяного HBSS на три дополнительные промывки, повторно суспендируя гранулу в 5 миллилитрах градиентного раствора комнатной температуры после последней стирки. Кратковременно перебейте трубку на низкой скорости, пока раствор не станет гомогенизированным, прежде чем добавить в пробирку еще 5 миллилитров градиента плотности комнатной температуры. Теперь с помощью 10-миллиметровой пипетки осторожно и медленно добавьте в пробирку 10 миллиметров HBSS комнатной температуры, чтобы обеспечить образование градиента, и используйте центрифугу с качающимся ведром, чтобы изолировать популяции клеток путем разделения градиента плотности.

В конце центрифугирования используйте 10-миллилитровую пипетку, предварительно смоченную холодным HBSS, чтобы собрать от 5 до 10 миллилитров островкового слоя между градиентом плотности и HBSS. Перенесите островки в новую 50-миллилитровую пробирку, содержащую 20 миллилитров свежего, ледяного HBSS, и соберите клетки путем центрифугирования в центрифуге с качающимся ведром. Осторожно отсадите все, кроме последних 3 миллилитров надосадочной жидкости, не нарушая гранулы, и промойте островки еще не менее трех раз 20 миллилитрами свежего HBSS на одну стирку.

После последней стирки замените надосадочную жидкость на 4 миллилитра 37 градусов Цельсия RPMI 1640 medium и аккуратно покрутите трубку, чтобы выбить гранулу. Немедленно высыпьте островки в 100-миллиметровую чашку Петри и промойте трубку 5 миллилитрами свежей среды RPMI 1640, чтобы собрать оставшиеся островки, объединив промывку с другими островками.

Затем с помощью диссекционного микроскопа и наконечника пипетки объемом 20 микролитров выберите здоровые сферические или продолговатые, золотисто-коричневые островки с гладкой поверхностью из чашки Петри для переноса в новую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров полной среды RPMI 1640. Когда все островки будут собраны, поместите островки в стерильный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненный воздух на ночь.