Анализ внеклеточного потока в 3D-сфероидах: метод измерения метаболической активности сфероидов опухолей поджелудочной железы

- Раковые клетки поджелудочной железы взаимодействуют с ассоциированными с раком фибробластами в опухолевом микроокружении или TME. Эти взаимодействия модулируют метаболическую активность раковых клеток и влияют на прогрессирование рака.

Сфероиды – это клеточные агрегаты, которые повторяют ТМЭ in vitro. Таким образом, мы можем использовать эти сфероиды для проверки изменений метаболических функций опухоли с помощью анализа внеклеточного потока. Этот анализ измеряет внеклеточную концентрацию кислорода и протонов для определения аэробного и гликолитического метаболизма соответственно.

Начните с получения 3D-сфероидов соответствующего размера, полученных путем совместного культивирования клеток рака поджелудочной железы с фибробластами поджелудочной железы. Теперь перенесите сфероиды в планшет для анализа потока и накройте его сенсорным картриджем, содержащим исследуемые препараты. Проведите анализ на анализаторе внеклеточного потока.

Анализатор флюса пневматически вводит исследуемые препараты из картриджа датчика на пластину для анализа в определенные моменты времени. В ответ на испытуемые препараты клетки выделяют протоны и кислород в микрокамеру пластины, а флуорофоры, присутствующие в сенсорном зонде, измеряют эти уровни. Наконец, с помощью соответствующего программного обеспечения проанализируйте функциональность сфероидов.

В следующем протоколе мы продемонстрируем метод измерения метаболической функции опухолевых клеток поджелудочной железы, присутствующих в трехмерных сфероидах, с использованием анализа внеклеточного потока.

За день до метаболического анализа увлажните картридж зонда 200 микролитрами калибра для анализа на лунку в прилагаемой рабочей пластине и инкубируйте рабочую пластину в течение ночи во влажном инкубаторе без CO2 при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующее утро понаблюдайте за сфероидами в пластине роста под световым микроскопом, чтобы проверить их морфологию и общую однородность. Перенесите пластину роста на магнитный удерживающий привод и осторожно отасуньте примерно 120 микролитров питательной среды в лунку.

Аккуратно промойте сфероиды 120 микролитрами подогретой среды для анализа три раза. После последней промывки еще раз осмотрите сфероиды под микроскопом, чтобы убедиться, что сфероиды не смылись, и добавьте в каждую лунку по 180 микролитров теплой пробирной среды.

С помощью широкого расточительного наконечника осторожно отсасывайте один предварительно промытый сфероид из пластины роста для отталкивания клеток и аккуратно перенесите сфероид непосредственно в центр одной лунки сфероидной пластины, позволяя сфероиду упасть в центральную микрокамеру лунки под действием силы тяжести.

Когда все сфероиды будут перенесены, поместите планшет для анализа в инкубатор с увлажненным воздухом без CO2 и температурой 37 градусов Цельсия на один час. Во время инкубации расположите картридж с датчиком так, чтобы ряды от A до H находились с левой стороны, и поместите направляющую для заряжания на верхнюю часть картриджа таким образом, чтобы буква, соответствующая порту, подлежащему заряжанию, находилась в верхнем левом углу.

Если пластина была равномерно нагружена, откройте программное обеспечение для анализа и нажмите кнопку Шаблоны. Дважды щелкните по пустому шаблону и нажмите «Создать группы». На вкладке «Карта пластин» назначьте группы для пробирной пластины, соответствующей плану эксперимента, и выберите четыре угловые лунки в качестве фоновых лунок.

На вкладке Протокол прибора установите флажки Калибровка, Равновесие и Базовый цикл измерений. Нажмите кнопку Injections (Инъекции) и определите соединение для каждого порта. Измените количество циклов измерения на 6. Просмотрите Протокол и Краткое описание группы, затем сохраните шаблон дизайна анализа.

Основываясь на схеме анализа в качестве руководства, используйте многоканальную пипетку для дозирования каждого реагента непосредственно в отверстия для инъекций, удерживая направляющие загрузки на месте кончиками пальцев. Когда все реагенты будут загружены, снимите направляющую заряжания и удерживайте картридж на уровне глаз, чтобы визуально осмотреть отверстия для впрыска на предмет равномерной загрузки.

Перенесите картридж и вспомогательную пластину в анализатор внеклеточного потока и начните предварительную калибровку анализа. После калибровки замените рабочую пластину на предварительно нагретую пластину для анализа, содержащую 3D-сфероиды, и начните анализ. Когда анализ будет завершен, экспортируйте данные в соответствующее программное обеспечение для анализа данных.