Выделение стволовых клеток PDAC: метод выделения раковых стволовых клеток из опухолей поджелудочной железы

- Стволовые клетки рака поджелудочной железы или ЦСК являются подмножеством самовозобновляемых раковых клеток и могут привести к возникновению всей опухоли. ЦСК находятся в хорошо защищенной нише, состоящей из других клеток, таких как фибробласты, иммунные клетки, эндотелиальные клетки и компоненты внеклеточного матрикса, такие как цитокины и факторы роста. Взаимодействия, происходящие между клетками в такой среде, помогают ЦСК размножаться и увеличивать рост опухоли.

Для изучения свойств ЦСК мы выделяем их из опухолей поджелудочной железы. Начните с забора клеточной суспензии из ткани опухоли поджелудочной железы человека в питательной среде CSC. Далее высадите суспензию, состоящую в основном из фибробластов и ЦСК, на пластину, покрытую желатиновой оболочкой, и инкубируйте ее в течение желаемого времени. Фибробласты прилипают к поверхности желатина, оставляя свободно плавающие ЦСК в клеточной суспензии.

Возьмите небольшое количество клеточной суспензии и добавьте трипановый синий. Пипеткой поднесите эту смесь к гемоцитометру и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Трипановый синий проникает в мертвые клетки и окрашивает их в синий цвет, оставляя живые клетки бесцветными. Наконец, сохраните CSC для дальнейшего анализа.

В следующем протоколе мы изолируем ЦСК из опухолей поджелудочной железы.

- Чтобы изолировать раковые стволовые клетки из протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в стерильном шкафу биобезопасности, используйте стерильный скальпель и щипцы для измельчения человеческой опухоли в чашке для культуры размером 60 x 15 миллиметров, содержащей один миллилитр стерильного PBS, добавляя еще три-четыре миллилитра PBS по мере необходимости, пока ткань полностью не диссоциируется.

Переложите тканевую суспензию в стерильную коническую пробирку и добавьте PBS до конечного объема в пять миллилитров. Затем механически гомогенизируйте образец с помощью диссоциатора, центрифуги и расщепите гомогенизированную ткань коллагеназой при температуре 37 градусов Цельсия.

Через час центрифугируйте ячейки, повторно суспендируя гранулу в 10 миллилитрах готовой среды. Отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микрометровое сетчатое фильтр и снова раскрутите клетки, на этот раз повторно суспендируя гранулу в пяти миллилитрах ACK.

Через пять минут при комнатной температуре удалите буфер для лизиса эритроцитов центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в среде раковых стволовых клеток. Затем инкубируйте клетки на покрытой желатином чашке при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы удалить большую часть быстро прикрепляющихся клеток фибробластов. Через час восстановите надосадочную жидкость и количественно определите количество жизнеспособных клеток рака поджелудочной железы.