JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:24 мин • April 30th, 2023
- Ганглий дорсального корешка или DRG — это сенсорные нейроны, которые передают сообщения с периферии в центральную нервную систему. Напротив, нейроны миентерального сплетения участвуют в перистальтических движениях кишечника.
При онкологических заболеваниях, таких как рак поджелудочной железы, эти нейроны изменяются морфологически и функционально. Чтобы изучить изменения морфологии нейронов, засейте нервные клетки на покровных листах, предварительно покрытых белком ламинина, поместите их в многолуночную пластину, и нанесите на клетки нейронную базальную среду.
Белок ламинина способствует росту нейритов. Инкубируйте клетки на ночь. Затем добавьте среду для экстракта ткани рака поджелудочной железы в первые три лунки и здоровую среду для экстракта ткани поджелудочной железы в последующие три лунки. Инкубируйте тарелку. Теперь проведите иммуногистохимическое окрашивание с использованием нейрон-специфических маркеров антител, которые связываются с нейронами. Поместите покровное стекло на предметное стекло и поместите предметное стекло под перевернутый микроскоп. Измерьте плотность нейритов с помощью программного обеспечения.
Нейроны DRG, культивируемые в экстракте ткани рака поджелудочной железы, обычно демонстрируют большую плотность нейритов, чем в экстракте здоровой ткани поджелудочной железы. Напротив, нейроны миентерального сплетения образуют более длинные невриты, чем в экстрактах здоровой ткани поджелудочной железы. В следующем протоколе мы проведем анализ нейропластичности in vitro на нейронах DRG и миентерального сплетения новорожденной мыши.
- Чтобы подготовить клетки к культивированию, с помощью гемоцитометра оценивают общее количество нейронов и глии. Затем засейте ячейки на 13-миллиметровые покровные стекла с предварительным покрытием в 24-луночный планшет. Используемое покрытие зависит от целей эксперимента. Затем долейте лунки нейронной базальной средой и дайте клеткам прикрепиться к лункам на ночь. На следующий день разморозьте тканевой экстракт с добавкой среды, или с клеточной линией надосадочной жидкости, дополненной средой.
Затем отсасывайте среду из DRG и выполняйте необязательную, очень щадящую промывку PBS. Затем медленно пипетируйте питательную среду с тканевым экстрактом или питательную среду для надосадочной жидкости клеточной линии на клетки до получения 100 микрограммов на миллилитр. Теперь дайте клеткам расти в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия в тканевой экстракте или питательной жидкости, поставляемой для надосадочной линии. Через 48 часов аспирируйте среду и зафиксируйте в 4% параформальдегиде для иммуноокрашивания.
Для двойного иммунофлюоресцентного окрашивания используют нейрон-специфические и глиа-специфические маркеры. Для морфометрии используйте микроскоп с инвертированным светом, оснащенный ПЗС-камерой в сочетании с автоматизированным программным обеспечением для измерения плотности нейритов. Используя 200-кратное увеличение, измерьте плотность нейритов в культурах нейронов, наложив сетку 50 X 50 микрон и подсчитав плотность волокон на квадрат, измеренную в пересекающихся волокнах. Повторите этот анализ для четырех различных областей наиболее плотного роста на четырех-пяти репрезентативных микрофотографиях на каждом покровном листе.
Измерьте рост нейритов, среднее количество ветвей на нейрон, среднюю длину ветвей и перикариональный размер по 30 случайно выбранным одиночным нейронам из каждого покровного листа, отметив нейриты и перикарии.