Мониторинг микроокружения опухоли на основе ПТМ: метод отслеживания изменений жесткости ВКМ с использованием сфероидов опухолей

- При опухолевой инвазии периферические опухолевые клетки претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход или ЭМП, что приводит к локальной деградации внеклеточного матрикса или ВКМ. Мы можем изучать взаимодействие опухолевых клеток с ВКМ in vitro.

Для изучения этих взаимодействий перенесите предварительно сформированный сфероид, полученный из опухолевых клеток поджелудочной железы, на пластину, содержащую коллагеновый каркас, вместе со встроенными флуоресцентными индикаторными зондами и культуральными средами. Сфероид опухоли высвобождает протеазы, которые разрушают коллаген и снижают жесткость ВКМ, что приводит к свободному перемещению индикаторных зондов в ВКМ.

Инкубируйте пластину в течение желаемого времени. Понаблюдайте за образцом под световым микроскопом, чтобы посмотреть на сетку точек образца в коллагеновом каркасе и записать с них видеоданные. Область матрицы вблизи сфероида показывает максимальную деградацию коллагена. Следовательно, он имеет увеличенное движение зонда. Напротив, область, удаленная от сфероида, демонстрирует меньшую деградацию коллагена, что приводит к ограничению движения молекул зонда.

Этот метод изучения реологических свойств ECM путем измерения траекторий индикаторных частиц известен как микрореология слежения за частицами или PTM. В следующем протоколе мы выполним анализ формирования сфер для идентификации стволовых клеток рака поджелудочной железы и оценки эффекта метформина.

Для начала подготовьте рабочее место внутри ламинарного вытяжного шкафа с двумя 2-миллилитровыми флаконами. Флакон 1 будет содержать сфероид опухоли, а флакон 2 будет бесклеточным контролем. Приготовьте разбавленную смесь модифицированных карбоксилатами флуоресцентных индикаторных зондов диаметром 1 микрон, добавив 2 части стандартных зондов к 25 частям стерильной воды.

Достаньте из холодильника флакон с 3,1 миллиграммом бычьего коллагена на миллилитр и поставьте его на лед. Аликвота 125 микролитров коллагена с последующим вводом 50 микролитров разведенного раствора индикаторного зонда во флакон 1. Вихрь кратковременно распределить по щупам.

Затем добавьте 235 микролитров соответствующей среды для клеточных культур, содержащей феноловый красный, в общем объеме 410 микролитров и кратковременно перемешайте, прежде чем удалить 205 микролитров и поместить его во флакон 2. Затем добавьте примерно 2 микролитра 1 молярного гидроксида натрия во флакон 1, чтобы вернуть раствор к нейтральному pH. Вихрь коротко перемешать. Затем немедленно вернитесь на решетку для льда, чтобы смесь не начала затвердевать.

Аккуратно удалите 40 микролитров среды из лунки, содержащей сфероид опухоли. Сохраните эти 40 микролитров во время выполнения следующего шага. Проверьте лунку, чтобы убедиться, что сфероид был удален на предыдущем этапе. Если нет, поместите 40 микролитров обратно в лунку и повторите предыдущий шаг.

Если это было, добавьте в флакон 1 40 микролитров, содержащих сфероид. Осторожно перемешайте флакон 1 перед тем, как перелить смесь порциями по 60 микролитров в три отдельные лунки 96-луночной пластины. Осмотрите каждую лунку с помощью микроскопа после добавления смеси, чтобы определить, в какой лунке содержится сфероид.

Затем добавьте примерно 2 микролитра 1 моляра гидроксида натрия и 40 микролитров среды для клеточных культур во флакон 2 и сделайте вортекс перед тем, как аликвотировать 60 микролитров этой смеси в пустую лунку в 96-луночном планшете и пометить его как бесклеточный контроль. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия для выздоровления не менее чем на один час.

Чтобы построить сетку точек отбора проб, сначала перенесите планшет с образцом из инкубатора на столик микроскопа. Подождите 10 минут, чтобы образец стабилизировался до комнатной температуры, если нагреваемый столик недоступен. Наблюдайте за образцом с помощью маломощных объективов, чтобы убедиться, что он цел и готов к визуализации. Определите положение опухоли в лунке и задокументируйте его с помощью изображения в проходящем свете для последующей пространственной совместной регистрации.

Как правило, 20 точек отбора проб в каждой лунке, распределенных по концентрическим кольцам вокруг сфероида, дают достаточно подробные результаты. Перемещайте предметный столик в нужное положение и используйте программное обеспечение для сопряжения микроскопа для записи координат x и y.

Переключите микроскоп на мощную линзу объектива и выберите подходящий куб фильтра для длины волны возбуждения трассирующих зондов. Используя список созданных точек, перейдите к первой точке в сетке. Отрегулируйте фокус так, чтобы найти дно лунки, прежде чем двигаться вверх, чтобы найти поле зрения, содержащее несколько сфокусированных трассирующих щупов.

Наблюдайте за гистограммой интенсивности и регулируйте интенсивность и время экспозиции, чтобы обеспечить максимально возможный динамический диапазон, гарантируя, что изображение не станет насыщенным. Получите видеопоследовательность с частотой кадров от 20 до 30 миллисекунд на кадр и сохраните ее с помощью соответствующего соглашения об именовании. Во время записи не прикасайтесь к микроскопу или столу.

Повторите запись для каждой точки выборки в сетке. Затем повторите процесс, чтобы построить сетку для каждой скважины в эксперименте и повторить весь процесс для каждой временной точки в течение всего периода продольного мониторинга.