Обнаружение АФК с помощью окрашивания DCFH-DA: Измерение общего АФК в клеточных линиях колоректального рака

- Активные формы кислорода образуются преимущественно из митохондрий, когда электроны утекают из цепи переноса электронов. Эти электроны соединяются с молекулярным кислородом, образуя различные активные формы кислорода, или АФК. В раковых клетках происходит перепроизводство активных форм кислорода. Эти высокореактивные молекулы АФК могут окислительно повреждать мембраны, белки и ДНК внутри клетки.

Повышенный уровень АФК повреждает ДНК, что приводит к активации онкогенного сигнального пути, вызывающего прогрессирование рака. Поэтому жизненно важно определить уровни активных форм кислорода, вырабатываемых раковыми клетками.

Начните с забора раковых клеток из колоректального рака человека в соответствующую питательную среду. Затем засейте эти ячейки в многолуночный планшет и добавьте раствор DCFH-DA. Инкубируйте тарелку в течение желаемого времени. DCFH-DA проникает через клеточную мембрану. Попадая внутрь клетки, DCFH-DA превращается в DCFH в присутствии клеточного фермента эстеразы. Кроме того, в результате окисления DCFH активными формами кислорода образуются зеленые флуоресцентные молекулы.

Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом. Интенсивность зеленой флуоресценции указывает на уровень активных форм кислорода в клетке. В следующем протоколе мы используем краситель DCFH-DA для окрашивания активных форм кислорода в клетках колоректального рака.

- Чтобы испачкать клетки, удалите содержащую препарат среду и промойте их один раз ДМЭМ. Добавьте по 500 микролитров рабочего раствора DCFH-DA в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации извлеките DCFH-DA из лунок и промойте их дважды DMEM и один раз PBS.

Затем добавьте по 500 микролитров PBS в каждую лунку. Используйте зеленый флуоресцентный белковый канал на флуоресцентном микроскопе, чтобы получить репрезентативные изображения клеток. Затем удалите PBS и добавьте по 200 микролитров буфера для радиоиммуноципитации в каждую лунку.

Выдержите пластину на льду в течение пяти минут и соберите лизаты клеток в пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при давлении 21 130 x g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Затем перелейте 100 микролитров надосадочной жидкости на черную 96-луночную пластину. Используйте считыватель микропланшетов с длиной волны возбуждения 485 нанометров и длиной волны излучения 530 нанометров для измерения флуоресценции в каждой лунке.

Затем измерьте концентрацию белка с помощью теста Брэдфорда, переложив 1 микролитр надосадочной жидкости в прозрачную 96-луночную пластину со 100 микролитрами раствора для анализа белка. Используйте концентрации белка для нормализации интенсивности флуоресценции.