Циркулирующая экстракция микроРНК: метод выделения микроРНК из образцов плазмы с помощью органической экстракции и обогащения малых РНК

- МикроРНК или микроРНК — это небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов путем деградации мРНК или блокирования их трансляции в функциональные белки. Циркулирующие микроРНК являются потенциальными биомаркерами рака и могут быть экстрагированы из жидкостей организма, таких как плазма. Для начала смешайте плазму с денатурирующим раствором, который одновременно гомогенизирует образец и ингибирует рибонуклеазы, разрушающие РНК.

Обработайте кислотным фенол-хлороформом и центрифугой, чтобы разделить образец на две фазы: нижнюю органическую фазу, содержащую ДНК и белки, и верхнюю водную фазу, содержащую РНК. Восстановите водную фазу. Добавьте абсолютный этанол, чтобы осаждать РНК из раствора.

Доведите концентрацию этанола в образце до 25%, чтобы задать начальное условие, способствующее разделению больших РНК. Переложите смесь в заранее собранный фильтрующий картридж и центрифугу. Крупные РНК избирательно иммобилизуются на фильтре, в то время как более мелкие микроРНК собираются в фильтрате.

Впоследствии увеличьте концентрацию этанола до 55% для выделения микроРНК. Перенесите фильтрат в новый фильтрующий картридж и центрифугу, чтобы захватить микроРНК. Поместите картридж на сборную трубку и добавьте подходящий буфер для элюирования. Центрифуга для вымывания микроРНК в пробирку. В следующем протоколе мы покажем выделение циркулирующей микроРНК из плазмы пациентов с колоректальным раком.

Для начала перенесите 400 микролитров образца плазмы в 2-миллилитровую пробирку объемом 2 миллилитра без РНКазы. Затем добавьте в пробирку 400 микролитров денатурирующего раствора. Добавьте 4 микролитра 1 наномолярного спайка.

После смешивания раствора добавьте 800 микролитров кислотного фенол-хлороформа. Вортексируйте раствор в течение 60 секунд и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 15 минут. Далее переложите за лизат, содержащийся в верхней водной фазе, в чистую пробирку, стараясь не нарушить интерфазу.

Измерьте объем восстановленной водной фазы и добавьте в лизат 1/3 объема этанола. Затем поместите фильтрующий картридж в свежую сборную пробирку. Перенесите до 700 микролитров смеси лизата этанола в фильтрующий картридж. Центрифугируйте картридж фильтра в течение 30 секунд при давлении 10 000 x g.

Далее измерьте общий объем проточного потока. Затем добавьте в фильтрат 2/3 объема этанола и хорошо перемешайте. Поместите второй фильтрующий картридж в свежую сборную пробирку. Затем перелейте до 700 микролитров образца в картридж и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 секунд, прежде чем отбросить проточный поток.

Добавьте 700 микролитров промывочного раствора микроРНК в картридж фильтра и центрифугируйте его с помощью сборной пробирки при давлении 10 000 х г в течение 15 секунд. Выбросьте проточный канал и вставьте картридж фильтра обратно в ту же трубку.

После этого переместите фильтрующий картридж в новую сборную трубку. Затем добавьте в картридж 100 микролитров предварительно подогретого раствора для элюирования. Центрифугируйте фильтрующий элемент при давлении 10 000 x g в течение 30 секунд, чтобы восстановить микроРНК.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).